袁桃花， 李欣芯， 陳麗亞， 曹勝宇， 孫見飛， 劉華， 吳昌學， 吳寧*

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院, 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種侵犯滑膜關節(jié)的慢性、炎癥性自身免疫系統(tǒng)疾病[1]，主要表現(xiàn)為關節(jié)紅腫、畸形等，致殘率在所有關節(jié)病中高居首位[2-3]。目前，臨床上沒有特異且有效的治療RA藥物[4-5]。苗藥驗方“四大血”(sidaxue，SX)由苗藥黑骨藤、見血飛、五花血藤、雞血藤4味藤本藥材組成，是苗族地區(qū)治療氣血瘀阻等疾病的天然藥方，也是其作為治療RA的特有藥方，但至今僅為經(jīng)驗用藥階段，關于其治療RA的作用機制研究較少[6]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，SX對佐劑性關節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠有良好的療效，能緩解關節(jié)腫脹程度、抑制關節(jié)滑膜組織增生等病理表現(xiàn)[7-8]。膠原誘導關節(jié)炎大鼠(collagen induced arthritis in rats，CIA)關節(jié)局部的炎癥等病理表現(xiàn)與RA相似，是研究RA的常用模型[9-10]，本研究通過復制CIA大鼠動物模型，采用不同劑量的SX對其治療，觀察SX治療前后CIA大鼠關節(jié)足腫脹度(ER)、病理組織變化， 分析SX對CIA大鼠白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)含量的影響，評估SX對RA的治療效果、探討其作用機制，為臨床開發(fā)SX提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及藥物 42只SD(Sprague Dawley)大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由Chongqing Tengxin Biological Technology Co. Ltd提供，合格證號[SCXK(渝)2007．005]；苗藥SX由貴州中醫(yī)藥大學苗醫(yī)藥教研室提供并經(jīng)田振華副教授鑒定，雷公藤多苷片購自HUANGSHI FEIYUN CO.LTD，20080301；Freund’S Complete Adjuvent(IFA)購自美國Sigma公司，批號033K8933。

1.1.2主要試劑 大鼠IL-17 ELISA試劑盒購于Shenzhen zike Biological Technology，大鼠VEGF試劑盒購于安徽巧伊生物技術(shù)有限公司，Prime ScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自TaKaRa Biomedical Technology (Beijing)，AceQ qpCR SYBR Green Master Mix購自Vazyme Biotech Co,Ltd，多功能酶標儀為美國，熒光定量pCR儀為Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1分組 42只SD大鼠隨機分為空白對照組(NG組，n=7)和造模組(n=35)，造模組大鼠用牛Ⅱ型膠原適量與等量不完全弗氏佐劑混合乳化劑于尾根部皮下注射復制CIA動物模型，造模第14天時將造模組大鼠分為5組，即模型對照組(Mod組，n=7)，SX 高、中、低藥物治療組( 40、20、10 g/kg組，n=7)以及陽性藥物對照組(雷公藤多甙片，GTW組，n=7)。

1.2.2構(gòu)建CIA動物模型 將4 g/L牛Ⅱ型膠原與等量不完全弗氏佐劑在冰上充分混勻乳化后，滴一滴于水中不擴散，取乳劑200 μL于大鼠尾根及左足墊部皮下注射，NG組用等量生理鹽水(physiological saline，NS)注射，一周后加強免疫，總計300 μL；造模第14天時，通過關節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)評分判定造模情況[11]。AI評分標準：關節(jié)無紅腫為0分，關節(jié)有紅色斑點或輕度腫脹為1分，關節(jié)病變并有中度紅腫為2分，關節(jié)除中度紅腫外并伴有輕度功能障礙為3分，關節(jié)重度紅腫、僵直甚至畸形并伴嚴重功能障礙為4分；AI評分≥2分為造模成功。

1.2.3SX制備 給藥單味苗藥五花血藤、雞血藤、見血飛、黑骨藤按照15∶22∶15∶8的比例配制，共取2 000 g，參考文獻[6-8]煎制成濃度為4 kg/L的試藥(按生藥量計)，置于4 ℃冰箱備用。給藥方案：造模成功后，藥物治療組大鼠按0.1 L/kg劑量給予SX進行灌胃治療，SX 40 g/kg、20 g/kg、10 g/kg組濃度依次為4 g/mL、2 g/mL及1 g/mL，GTW組按4 g/mL進行灌胃，NG組和Mod組用等量NS灌胃，灌胃給藥21 d。

1.3 觀察指標

1.3.1足趾ER測量 造模前及造模第7、14天，給藥第7、14及21天時，采用自制足腫儀測量大鼠左右后足跖容積，反復3次取均值，計算足趾ER，公式為ER(%)=(V1-V2)/V2×100%(其中V2為造模前的容積，V1造模后的容積)。

1.3.2標本采集及大鼠血清IL-17、VEGF的含量 給藥第21天，最后一次SX灌胃結(jié)束時，用10%水合氯醛麻醉大鼠，心臟取血，常溫下垂直靜置2 h，見淡黃色血清析出后，3 000 r /min離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測定大鼠血清IL-17、VEGF含量，操作步驟按試劑盒說明書進行；同時取出大鼠滑膜組織，部分制作病理組織切片，觀察其炎癥反應，部分用于檢測VEGFmRNA表達。

1.3.3大鼠關節(jié)滑膜組織的炎癥反應及VEGFmRNA表達 取大鼠關節(jié)滑膜組織制作的病理組織切片，4%中性甲醛固定液中進行固定，觀察其炎癥反應；采用實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)法檢測大鼠關節(jié)滑膜組織VEGFmRNA表達水平，根據(jù)GenBank提供的大鼠VEGFmRNA序列(AY702972)、GApDHmRNA序列(內(nèi)對照，NM_017008)；進行引物設計并合成，VEGF上游引物為5′ CCTGGCTTTACTGCTGTACCT 3′，下游引物為5′ GCTGGTAGACGTCCATGAACT 3′；GApDH上游引物為5′ GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC 3′，下游引物為5′ GGTTCACACCCATCACAAACATG 3′；提取樣本總RNA，溶于DEPC水中(-80 ℃保存?zhèn)溆?，用超微量紫外分光光度計測RNA樣品A260/280值及濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA樣本，采用pCR操作擴增目的基因，條件為95 ℃預變性 5 min， 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s循環(huán)40次，溶解曲線擴增條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，用2^-△△CT法處理實驗數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠足趾外觀變化

在造模第7天時，NG組大鼠生理狀態(tài)正常、毛色光滑，體重增加。而Mod組部分大鼠注射乳化劑的關節(jié)出現(xiàn)輕微紅腫，活躍程度降低，毛色光澤下降；造模第14天時，Mod組大鼠致炎關節(jié)基本都出現(xiàn)不同程度的紅腫，甚至無法直立行走，活動程度整體降低，毛色缺乏光澤。藥物治療第7天時，與NG組比較，SX 40 g/kg、20 g/kg組、GTW組大鼠活動程度稍微變大，部分大鼠關節(jié)紅腫開始減退；治療第14天時，除SX 10 g/kg組外，各治療組大鼠關節(jié)紅腫情況都開始得到緩解；治療第21天時，SX 10 g/kg組小部分大鼠關節(jié)有輕度紅腫，但均能正常行走，其余各治療組大鼠關節(jié)紅腫消退，大鼠狀態(tài)良好。見圖1。

注：A、B、C、D、E及F依次為NG、Mod、GTW、SX 40 g/kg、SX 20 g/kg及SX 10 g/kg組圖1 各組大鼠藥物治療第21天時足趾外觀Fig.1 Joint swelling degree of rats in each group after 21th day of drug treatment

2.2 大鼠后足趾關節(jié)ER

造模第14天時，除NG組外，其余各組大鼠左右后足趾均表現(xiàn)紅腫，經(jīng)過SX及GTW治療后，灌胃給藥第7天時，與Mod組比較，各組大鼠后足趾ER均不同程度下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，藥物治療第14、21天時，SX和GTW治療組與Mod組比較，后足趾ER均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

分組造模第14天給藥第7天第14天第21天NG組0.14±0.030.12±0.050.11±0.010.15±0.04Mod組0.57±0.07(1)0.85±0.22(1)0.82±0.24(1)0.88±0.23(1)GTW組0.43±0.08(1)0.37±0.16(1)(3)0.29±0.04(1)(3)0.20±0.06(1)(3)40 g/kg組0.42±0.09(1)0.35±0.16(1)(2)0.27±0.07(1)(3)0.15±0.01(1)(3)20 g/kg組0.50±0.02(1)0.39±0.20(1)0.30±0.14(1)(3)0.17±0.15(1)(3)10 g/kg組0.54±0.11(1)0.41±0.11(1)0.39±0.12(1)(3)0.19±0.07(1)(3)

(1)與NG組比較，P<0.01；與Mod組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01

2.3 血清IL-17及VEGF含量

給藥第21天時，與NG組比較，Mod組血清IL-17、VEGF含量升高(P<0.05)；與Mod組比較，NG、SX 40 g/kg組血清IL-17含量下降(P<0.05)，SX 20 g/kg、GTW組血清IL-17含量下降更明顯(P<0.01)；與Mod組比較，SX 40、20、10 g/kg組及GTW組血清中VEGF含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-17及VEGF含量Tab.2 Serum IL-17, VEGF content in each group of CIA rats

與NG組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01；與Mod組比較，(3)P<0.05，(4)P<0.01

2.4 大鼠滑膜組織HE染色

從圖2中可以看出，NG組大鼠滑膜組織由1～2層滑膜細胞構(gòu)成，分布緊密、整齊，無炎癥細胞的浸潤及血管增生；Mod組大鼠滑膜組織排列紊亂、增生明顯，多達5～6層排列，且組織水腫嚴重，周圍可見大量炎性細胞浸潤、血管增生現(xiàn)象，在軟骨面，還可見部分軟骨細胞增生。SX 10 g/kg組較Mod組的滑膜組織水腫程度較Mod組有所改善，增生及炎細胞浸潤現(xiàn)象均減少；而SX 40 、20 g/kg組及GTW組僅可見少量的炎性細胞浸潤及新生組織血管，增生較少，沒有明顯的軟骨及骨組織的破壞，提示滑膜組織病理狀況明顯改善。

2.5 SX對CIA大鼠滑膜關節(jié)組織VEGF mRNA表達的影響

給藥第21天時，與NG組相比，Mod組VEGFmRNA的表達顯著升高(P<0.05)；與Mod組比較，SX 40 g/kg、10 g/kg組VEGFmRNA表達顯著降低(P<0.05)；SX各組與GTW組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 VEGF mRNA在大鼠滑膜組織中的表達Tab.3 Expression of VEGF mRNA in synovial tissue of CIA rats

(1)與NG組比較，P<0.05，(2)與Mod組比較，P<0.05

3 討論

RA作為一種系統(tǒng)性的慢性自身免疫疾病，在全球均有發(fā)病，在我國，其患病率為0.32%～0.36%，是造成人類喪失勞動力和致殘的主要原因之一[1-3]，其病變可以累及全身不同臟器(如肺、心、腎、神經(jīng)及消化系統(tǒng)等)[12]，但尤以關節(jié)受累最為突出，其病理表現(xiàn)為多發(fā)性外周關節(jié)炎，關節(jié)局部紅腫，嚴重致關節(jié)畸形，病理變化為增生性滑膜炎，關節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕，關節(jié)腔內(nèi)有炎性細胞浸潤[13]。目前，臨床上沒有治療RA的特效藥物，且常用的藥物如改善關節(jié)炎癥狀的非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、改變病情抗風濕藥(disease modifying anti-rheumatic drug，DMARDs)等均具有一定的毒副作用[14]。RA作為難治性疾病之一，目前無法根治，國內(nèi)外學者為了更好地對RA開展研究，根據(jù)RA的病因病機、病理學、免疫學特點等進行了大量的動物試驗，形成了一些較為成熟的AA、CIA模型動物模型，二者在臨床表現(xiàn)、實驗室指標和病理機制上與人RA有著相似的特點，是常用的兩種RA模型，其中CIA模型較為穩(wěn)定，是研究RA發(fā)病機制和篩選治療RA藥物的理想模型，也是目前國際上公認的關節(jié)炎模型[9-10]。而RA作為一種慢性免疫性炎癥疾病，目前發(fā)病機理尚不清楚，而機體炎癥反應與多種促炎細胞因子密切相關，在RA中白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-17、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)等炎癥因子介導的炎癥反應在RA滑膜的病變過程中起重要作用，其中IL-17 已被證實在組織炎癥、自身免疫和宿主防御機制中發(fā)揮著關鍵作用，是一種較強的炎性細胞因子，RA患者關節(jié)滑液中出現(xiàn)高水平IL-17[15-17]。目前許多研究證實炎癥因子(如TNF-α、IL-1β)的異常表達是RA發(fā)病及血管形成的重要原因，近年來，人們發(fā)現(xiàn)在RA的滑膜病變過程中有豐富的血管形成因子的表達，其中VEGF是一種特異作用于血管內(nèi)皮細胞的多功能細胞因子，是促血管生成的主要因素之一，是目前已知的作用最強的促血管生成因子，其能增加 RA微血管通透性，促使RA血管新生，加重血管翳癥狀[18-20]。實驗研究證實，SX能減輕CIA大鼠關節(jié)腫脹程度，較好的改善CIA模型大鼠關節(jié)組織病理狀況，且SX 40 g/kg改善明顯，SX能下調(diào)血清中IL-17及VEGF的表達，且下調(diào)VEGF的水平比IL-17的稍高，初步說明在CIA大鼠的病理表現(xiàn)中，SX下調(diào)血管因子VEGF的作用比炎癥因子IL-17的作用稍強。同時，本研究還檢測出SX 10 g/kg對CIA大鼠血清IL-17的影響較小，而對于VEGF則是SX 40 g/kg影響相對較小，說明RA血管翳程度與炎癥反應在一定程度上不呈正向發(fā)展關系。

注：A、B、C、D、E及F依次為NG、Mod、GTW、SX 40 g/kg、SX 20 g/kg及SX 10 g/kg組圖2 各組大鼠滑膜組織HE染色結(jié)果(400×) Fig.2 Pathological tissue section of each group

綜上所述，SX能通過調(diào)節(jié)IL-17、VEGF含量的變化對CIA大鼠病情的改善起到積極的作用，這為下一步深入研究SX通過調(diào)控VEGF及IL-17發(fā)揮對RA治療的具體作用機制研究奠定基礎。