張鵬， 彭濤， 范安然， 蘭金芝， 何志旭， 舒莉萍**， 周艷華**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004; 3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科學(xué)教研室， 貴州 遵義 563000)

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA合成的時(shí)間不同，真核細(xì)胞周期的間期分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)[1]，S時(shí)期DNA含量處于G1時(shí)期和G2時(shí)期之間[2]。在正常細(xì)胞中，細(xì)胞周期的控制受到大量基因的調(diào)控[3]，這些基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)抑制具有重要作用，如果這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，細(xì)胞往往會(huì)發(fā)生損傷，從而進(jìn)一步發(fā)生凋亡[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)突變基因會(huì)使細(xì)胞周期發(fā)生變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖的異常[5-6]；在神經(jīng)退行性疾病中也伴隨著細(xì)胞周期的異常[7]，因此細(xì)胞周期的檢測(cè)對(duì)于神經(jīng)退行性疾病的診斷及發(fā)病機(jī)制的研究具有重要的作用。在目前眾多的細(xì)胞周期檢測(cè)方法中[8-9]，流式細(xì)胞術(shù)是基于細(xì)胞內(nèi)DNA含量的細(xì)胞周期檢測(cè)的最常用方法[9-10]。碘化丙啶(propidium iodide，PI)作為一種核酸物質(zhì)的染料在流式檢測(cè)細(xì)胞周期的檢測(cè)中比較常用[11]，PI與DNA結(jié)合，經(jīng)488 nm激發(fā)光激發(fā)后發(fā)出630 nm的熒光，熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比[12-13]。但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，常常因?yàn)榧?xì)胞密度及實(shí)驗(yàn)操作的不同會(huì)導(dǎo)致染色結(jié)果的不穩(wěn)定，從而造成細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果不可靠[14]。Alexa Fluor 488 NHS Ester染料含有N-羥基琥珀亞胺(N-Hydroxysuccinimide)活化基團(tuán)， Alexa Fluor 488熒光基團(tuán)，能直接與生物分子上的氨基(-NH2)反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，可用于標(biāo)記任何含伯胺的生物分子[5]，被標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與染料濃度在一定范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系[15-16]。為解決流式細(xì)胞檢測(cè)中引起結(jié)果不穩(wěn)定的細(xì)胞密度及實(shí)驗(yàn)操作的問(wèn)題，本研究使用不同濃度的Alexa Fluor 488 NHS Ester染料處理不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，將不同組細(xì)胞進(jìn)行“標(biāo)記”后混合在一起進(jìn)行常規(guī)流式細(xì)胞檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)采用不同濃度Alexa Fluor 488 NHS Ester染料預(yù)染細(xì)胞后混合在一起進(jìn)行PI染色，能夠提高細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果的可信性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

細(xì)胞周期檢測(cè)采用BD Pharmingen細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒(550825)，流式細(xì)胞儀為貝克曼FC500型，血清為Biological Industries公司胎牛血清，Alexa Fluor 488 NHS Ester染料購(gòu)自Thermo Fisher公司；293細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞處理 293細(xì)胞采用添加10% FBS的DMEM于4×3的12孔板中培養(yǎng)，每行4個(gè)孔分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ組，每列3個(gè)孔為重復(fù)孔。細(xì)胞傳代培養(yǎng)48 h后消化收取細(xì)胞于離心管中，離心去上清液后采用預(yù)冷的70%乙醇溶液固定細(xì)胞；Alexa Fluor 488 NHS Ester染料用甲醇溶解，配制成濃度為50 mg/L的儲(chǔ)存液，使用時(shí)用PBS將其稀釋成待用濃度。

1.2.2細(xì)胞染色 取乙醇固定細(xì)胞，每組分為兩份，一份按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色(方案一)；另一份先將各組細(xì)胞分別用0.0、0.4、2.0及10.0 mg/L的Alexa Fluor 488 NHS Ester染料室溫染色15 min，離心洗滌兩次去除染色液，然后將各組細(xì)胞混合于一支試管中，再使用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒進(jìn)行染色(方案二)。

1.2.3上機(jī)檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析 按照方案一染色的細(xì)胞，每組細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒染色15 min后，用200目篩過(guò)濾至流式上樣管中分別上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣品獲得的檢測(cè)結(jié)果采用Flowjo X流式數(shù)據(jù)分析軟件單獨(dú)分析。方案二染色的細(xì)胞，4組細(xì)胞混合于一支試管中，1次上樣，獲得的數(shù)據(jù)同樣采用Flowjo X流式數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 方案一的細(xì)胞周期

由圖1可見(jiàn)，在采用常規(guī)細(xì)胞周期檢測(cè)方法染色時(shí)，方案一Ⅲ組第一次檢測(cè)結(jié)果(圖1 方案一Ⅲ組A)與其他組(Ⅰ，Ⅱ和Ⅳ)不一致，Ⅲ組A的熒光信號(hào)在坐標(biāo)軸上偏左(圖中黑色箭頭所指)。分析原因發(fā)現(xiàn)，與其他各組相比，在采用低速上樣的時(shí)候，方案一Ⅲ組A的上樣速度超過(guò)400個(gè)/s，而其他各組上樣速度處于200個(gè)/s左右(表1所示)，說(shuō)明方案一Ⅲ組A試管中細(xì)胞密度明顯高于其他各組，最終導(dǎo)致染料相對(duì)不足，致使細(xì)胞染色不充分。為了驗(yàn)證染料不足的原因，試驗(yàn)過(guò)程中向Ⅲ組A的試管中補(bǔ)加了一倍的PI染液(標(biāo)記為方案一Ⅲ組B)，染色15 min后重新上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖中方案一Ⅲ組B所示，熒光信號(hào)值恢復(fù)至與其他各組一致的水平(圖中灰色箭頭所指)。

注：黑色箭頭所指為Ⅲ組A 的熒光信號(hào)在坐標(biāo)軸上偏左，灰色箭頭為Ⅲ組B熒光信號(hào)值恢復(fù)至與其他各組一致的水平圖1 方案一獲得的各組細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The result of cell cycle detection using traditional method

表1 方案一各組細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上樣時(shí)每秒檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)(個(gè)/s)Tab.1 Cell number per second in flow cytometry analysis using traditional method

2.2 不同濃度Alexa Fluor 488 NHS Ester染色后細(xì)胞分群

如圖2所示，經(jīng)過(guò)0.0、0.4、2.0及10.0 mg/L Alexa Fluor 488 NHS Ester染色后，4組細(xì)胞混合在一起上樣，經(jīng)Flowjo X流式分析軟件分析，可見(jiàn)細(xì)胞在FL1通道明顯分為4群。表明采用上述濃度的Alexa Fluor 488 NHS Ester染料能將不同組的細(xì)胞貼上不同的“標(biāo)簽”。

2.3 方案二的細(xì)胞周期

不同濃度Alexa Fluor 488 NHS Ester染色后，將4組細(xì)胞混合成一管，使用PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，然后使用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)Alexa Fluor 488 NHS Ester染料和PI的信號(hào)(圖3A)。通過(guò)Alexa Fluor 488 NHS Ester信號(hào)可以將細(xì)胞分為4組(圖3B)，通過(guò)PI信號(hào)對(duì)4群細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞周期分析，與圖1比較其結(jié)果一致性更好，不同組熒光信號(hào)分布相似(圖3C所示)。

注：A為散點(diǎn)圖，B為細(xì)胞在525 nm通道的分群情況，C為細(xì)胞在525 nm+SSC通道分群情況圖2 不同濃度Alexa Fluor 488 NHS Ester染料后細(xì)胞細(xì)胞分群結(jié)果Fig.2 Cell population after staining with defferent amount of Alexa Fluor 488 NHS Ester

圖3 改進(jìn)后的流式細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The result of cell cycle detection using "improved" flow cytometry method

3 討論

阿滋海默癥(alzheimer disease，AD)等神經(jīng)退行性疾病中往往伴隨著細(xì)胞周期的異常[6]。因此尋找優(yōu)化的方法檢測(cè)細(xì)胞周期對(duì)于神經(jīng)退行性疾病的研究就有非常重要的作用。在采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的研究中，多數(shù)學(xué)者會(huì)根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒的推薦方案進(jìn)行染色[17]。不同試劑公司的試劑盒染色方案有所不同[18]。很少有學(xué)者關(guān)注染色方案的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。多數(shù)學(xué)者熟悉染色步驟后，即使購(gòu)買(mǎi)的是不同品牌的試劑，習(xí)慣性的按照所熟悉的步驟進(jìn)行染色，但是檢測(cè)結(jié)果往往存在不可重復(fù)性[19]。其次，在進(jìn)行藥物抑制實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖逐漸被抑制，細(xì)胞密度逐漸降低[20]。相比較而言，對(duì)照組的細(xì)胞增殖較快，密度較大。但實(shí)際操作中，很少有研究者在染色前將各組的細(xì)胞密度調(diào)整至相同數(shù)量再進(jìn)行染色[21]。本研究中，方案一Ⅲ-A組的細(xì)胞信號(hào)峰值偏小，可能是因?yàn)樵摻M細(xì)胞密度較高，染料相對(duì)不足，致使細(xì)胞染色不充分，熒光信號(hào)相對(duì)偏弱造成；流式細(xì)胞儀的上樣速度也顯示出方案一Ⅲ組-A的上樣速度最大，表明該組細(xì)胞密度較大。通過(guò)補(bǔ)加染料后，細(xì)胞信號(hào)峰的位置恢復(fù)正常，細(xì)胞上樣速度也與其他分組的上樣速度接近了。再者，經(jīng)70%乙醇固定后的細(xì)胞要經(jīng)過(guò)3次離心洗滌，去除乙醇，然后再進(jìn)行染色，在洗滌過(guò)程中極易造成細(xì)胞丟失[22]。所以最終各處理組的細(xì)胞密度不盡相同，因此導(dǎo)致加入染色液一致的情況下各組細(xì)胞的著色不一致，造成上機(jī)檢測(cè)時(shí)信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)差異[23]。本實(shí)驗(yàn)研究Alexa Fluor 488 NHS Ester染料在細(xì)胞周期檢測(cè)中使用的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在常規(guī)流式細(xì)胞檢測(cè)之前，通過(guò)不同濃度的該染料對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色，給各組細(xì)胞貼上一個(gè)“標(biāo)簽”，而后將細(xì)胞外未著色的染料洗滌去除后，將各組細(xì)胞混合于一組中進(jìn)行PI染色。此方法可保證組內(nèi)所有細(xì)胞所處的處理方式以及檢測(cè)條件的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)貼“標(biāo)簽”的細(xì)胞，在數(shù)據(jù)分析時(shí)，“標(biāo)簽”可以輕易的將各組細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。通過(guò)對(duì)各“標(biāo)簽”組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，所得的周期檢測(cè)結(jié)果一致性更高。

綜上所述，采用不同濃度Alexa Fluor 488 NHS Ester染料預(yù)染細(xì)胞后混合在一起進(jìn)行PI染色能夠提高細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果的可信性，在神經(jīng)退行性疾病研究中可節(jié)約病人的取樣次數(shù)及數(shù)量。