張鵬， 舒莉萍， 周艷華**， 范安然**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 細胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室, 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州省再生醫(yī)學(xué)重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 成體干細胞轉(zhuǎn)化研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，在微管聚集和穩(wěn)定方面發(fā)揮重要的作用。正常狀態(tài)下，Tau蛋白自身幾乎不表現(xiàn)出聚集的傾向，但是Tau蛋白聚集形成的雙螺旋纖維以及神經(jīng)纖維結(jié)節(jié)是一系列神經(jīng)退行性疾病的主要特征，這些神經(jīng)退行性疾病被稱為Tau蛋白病，其中包括阿爾茨海默綜合征(alzheimer disease，AD)和亨廷頓病額顳葉癡呆等[1]。雖然Tau蛋白的聚集是導(dǎo)致這些神經(jīng)退行性疾病的原因，但是Tau蛋白在神經(jīng)退行性疾病形成聚集物的機制以及Tau蛋白的病理學(xué)傳播機制仍然存在爭議[2-3]。外泌體是后期胞內(nèi)體向內(nèi)出芽形成多泡體、是一類納米級別的生物膜封閉囊泡，隨后在多泡體與細胞膜融合后被釋放到胞外環(huán)境，這種起源過程賦予了外泌體具有與起源細胞類似的膜結(jié)構(gòu)，它們富含膽固醇脂閥、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺[4-5]。研究認為外泌體不僅僅是一種消除了多余蛋白或分子的垃圾處理囊泡，還可能是促進胞間交流的重要信使，不僅在正常的生理學(xué)過程中發(fā)揮作用，它們還與許多疾病的病理學(xué)相關(guān)[6-8]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞之間的信息傳遞中也發(fā)揮重要作用[9]。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可能是Tau蛋白在細胞之間傳遞的方式[10]；研究發(fā)現(xiàn)在AD病人中，其外泌體的Tau蛋白水平顯著升高[11]。因此本研究通過經(jīng)典的超速離心結(jié)合超濾法分離獲得HEK293-Tau細胞的外泌體，采用Western blot鑒定外泌體特異性標記物(HSP70、CD63及CD9)及外泌體和細胞培養(yǎng)液中Tau蛋白表達，報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)用血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰消化酶、100×非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇和100 000 U/L青鏈霉素均購自Gibco公司，外泌體鑒定抗體和無外泌體血清購自ABI公司，蛋白預(yù)染marker 購自Biorad公司，羊抗鼠IgG購自北京索萊寶科技有限公司，24孔板、T25培養(yǎng)瓶和25 cm培養(yǎng)板購自Corning公司產(chǎn)品，超速離心用離心管和100 KD超濾管購自Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HEK293-Tau細胞培養(yǎng)于T75的細胞培養(yǎng)瓶，并使用DME-F12完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基組成包括10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、10 mmol/L β-巰基乙醇、1%谷氨酰胺及1%青鏈霉素。每天觀察細胞生長狀態(tài)，3 d換液1次，細胞生長融合度為90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2外泌體分離 HEK293細胞培養(yǎng)在25 cm的細胞培養(yǎng)皿中，每皿加完全培養(yǎng)基液20 mL，收集前48 h換成無外泌體血清配制的培養(yǎng)基。48 h后收集細胞上清液200 mL(10塊細胞培養(yǎng)皿)，3 462 r/min離心10 min收集上清液，將上清液6 924 r/min繼續(xù)離心20 min去除細胞；再取上清液15 482 r/min 離心60 min去除細胞碎片。取上清液用Millipore 100 KD的超濾管濃縮至10 mL，濃縮后48 958 r/min離心90 min，取沉淀用PBS重懸，48 958 r/min離心90 min，PBS重懸沉淀，0.22 μm針頭式過濾器過濾，-80 ℃保存。

1.2.3外泌體標志物鑒定及Tau蛋白檢測 采用Western blot方法，配制10%的分離膠10 mL，分離膠凝好后配制4 mL濃縮膠。細胞裂解液以及上清的上樣體積為20 μL，將其分別于2×上樣緩沖液混勻后，置于100 ℃水浴煮10 min即可上樣；指示帶泳至膠底部時停止電泳，4 ℃轉(zhuǎn)膜過夜；轉(zhuǎn)膜完成后，取出PVDF膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗4 ℃過夜；次日取出PVDF膜用雙蒸水漂洗3次，10 min/次。然后加入二抗窒溫孵育1 h，雙蒸水漂洗3次，10 min/次；用ECL液室溫避光孵育，暗室顯影。

1.2.4外泌體測定 采用Sigma公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒測定，按照試劑盒說明進行操作，在第1孔添加標準品20 μL，2～8孔添加1% SDS 20 μL。然后在第2孔添加蛋白標準品20 μL，混勻后轉(zhuǎn)移20 μL到第3孔進行倍比稀釋，通過這種倍比稀釋的方法將樣品進行稀釋逐孔、共7孔，第7孔混勻后取20 μL丟棄。每孔加入BCA工作液200 μL，37 ℃孵育30 min。根據(jù)吸光度值繪制標準曲線，再根據(jù)各個樣本孔的吸光度值求得其實際濃度。

2 結(jié)果

2.1 外泌體形態(tài)

收集HEK293-Tau細胞培養(yǎng)液，超速離心結(jié)合超濾離心法，分離外泌體，分離的外泌體稀釋后在透射電鏡下進行形態(tài)觀察；外泌體生理狀態(tài)下是球狀結(jié)構(gòu)，但是由于脫水的原因會造成中間內(nèi)陷，使內(nèi)部折射變?nèi)?，電鏡下外泌體會呈現(xiàn)杯狀結(jié)構(gòu)。所以本研究所分離獲得的外泌體在電鏡下呈典型的杯狀結(jié)構(gòu)(圖1箭頭所示)。

圖1 透射電鏡下外泌體形態(tài)Fig.1 The morphology of isolated exosomes under transmission electron microscopy

2.2 外泌體表達特異性標記物

通過細胞裂解液獲取外泌體總蛋白，然后使用Western blot方法，用外泌體中特異性高表達的蛋白標記物進行鑒定。結(jié)果顯示，外泌體的特異性標記物HSP70(圖2A)、CD63(圖2B)和CD9(圖2C)都呈現(xiàn)陽性，與電鏡結(jié)果相結(jié)合，更進一步證明了所分離的外泌體的可靠性。

注：A為Hsp70、B為CD63、C為CD91，泳道1為外泌體蛋、2為細胞總蛋白圖2 外泌體標志物鑒定(Western blot)Fig.2 The expression of exosome markers on isolated exosomes

2.3 細胞裂解液、外泌體及細胞培養(yǎng)上清液中Tau蛋白表達

使用Tau12抗體對細胞培養(yǎng)上清液、細胞裂解液及外泌體進行Western blot分析，結(jié)果顯示，在細胞培養(yǎng)上清液、細胞裂解液及外泌體中都可以檢測到Tau蛋白表達(圖3)。

圖3 細胞、外泌體及細胞培養(yǎng)液中Tau蛋白表達(Western blot)Fig.3 Tau protein in isolated exosomes and supernatants derived culture media with HEK293-Tau cells

3 討論

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，在微管聚集和穩(wěn)定方面發(fā)揮重要的作用。正常狀態(tài)下，Tau蛋白自身幾乎不展現(xiàn)出聚集的傾向。但是在AD中，Tau蛋白會超磷酸化，導(dǎo)致其錯誤折疊以及聚集形成神經(jīng)纖維結(jié)節(jié)(neurofibromatosis，NFT)[12]。NFT沉積的出現(xiàn)是以一種獨特的可預(yù)測的時空特異性方式發(fā)生。Braak等[13]將Tau的傳播分為6階段，前兩個階段的主要特點是Tau先在旁嗅皮層然后在嗅皮層沉積，所以該階段也別稱為旁嗅皮層階段。這一階段，病人的絕大多數(shù)認知是正常的；在III、IV階段，NFT密集的出現(xiàn)在嗅皮層的前alpha區(qū)以及CA1區(qū)，海馬下托區(qū)也開始出現(xiàn)NFT；在IV階段CA4區(qū)、杏仁區(qū)、屏狀體、扣帶、丘腦核都受到影響。由于IV階段主要影響大腦的邊緣系統(tǒng)，所以該階段也叫邊緣期；這一階段病人開始表現(xiàn)出輕度認知障礙，但是仍可以進行日常工作；在第V、VI階段，病原性的Tau幾乎在海馬區(qū)的所有區(qū)域出現(xiàn)，病人表現(xiàn)出大規(guī)模的神經(jīng)元損失，也被稱為島旁區(qū)階段[13]。在AD進程中，Tau在大腦中的傳播多數(shù)情況下可以用突觸間傳播解釋，但是其側(cè)向傳播以及長距離傳播仍不能解釋，但Tau的這種傳播方式如果是通過大腦的外泌體傳播方式就可以解釋。最近已經(jīng)有研究開始探索AD中外泌體作用于錯誤折疊的Tau傳播的可能性[3]。

外泌體是一類納米級別的生物膜封閉囊泡，其存在于生物體液中，直徑在50～150 nm之間[14]。本研究獲得的外泌體在電鏡下直徑絕大多數(shù)位于這個范圍。外泌體通常可通過差速離心方法獲得，但是各個實驗室的獲得方法又有所不同。本研究采用超速離心結(jié)合超濾的方法非常有效的分離獲得了外泌體。外泌體生理狀態(tài)下是球狀結(jié)構(gòu)，但是由于脫水的原因會造成中間內(nèi)陷，使內(nèi)部折射變?nèi)?，電鏡呈現(xiàn)杯狀結(jié)構(gòu)[15]。本研究獲得的外泌體具有典型的杯狀結(jié)構(gòu)。并且外泌體由于其起源于多泡體，所以腔內(nèi)體的蛋白標記物被用來作為外泌體鑒定的標記，比如CD81、CD9、CD63和TSG102等[16]。本研究分離的外泌體經(jīng)鑒定HSP70、CD63和CD9均呈現(xiàn)陽，進一步證明本研究獲得的外泌體的可信度。

最近，有研究發(fā)現(xiàn)外泌體參與了Tau的病理學(xué)過程[17]，來源于小膠質(zhì)細胞的外泌體中的Tau參與大腦中Tau的病理學(xué)傳播，使用GW4869清除小膠質(zhì)細胞和抑制外泌體的合成能夠限制Tau在病人大腦中的傳播[18]。該研究認為小膠質(zhì)細胞能夠吞噬含有Tau蛋白病變的神經(jīng)元，隨后將Tau釋放到外泌體中來傳遞病變神經(jīng)元，小膠質(zhì)細胞來源的外泌體可以將Tau從嗅皮層(Tau病理學(xué)的最早位點之一)傳播到齒狀回區(qū)域(Tau晚期影響的區(qū)域，但是也在早期受到影響)，封閉nSMase2 抑制外泌體生物合成后可顯著減少Tau的傳播[18]。研究還發(fā)現(xiàn)外泌體中含有AD的典型生物標記Tau和Aβ[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)外泌體中確實存在Tau蛋白，說明了外泌體在Tau蛋白的傳播中可能發(fā)揮作用，在后期胞內(nèi)體內(nèi)陷形成多泡體的時候，在細胞中表達的Tau蛋白會隨之被分選到多泡體的腔內(nèi)體中，當(dāng)多泡體與細胞膜融合后釋放外泌體，此時tau蛋白會隨之被釋放到胞外空間。釋放的外泌體可以與相鄰以及不相鄰的細胞膜融合，并將其包含的外泌體再釋放到受體細胞中，從而造成Tau蛋白在不同細胞之間的傳播。

此外，外泌體中的蛋白質(zhì)的分選機制仍不清楚，但是似乎是被特異性分選的，因為它們與其親本細胞的組成不同[20]，并且外泌體中裝載的分子還會根據(jù)親本細胞的狀態(tài)而改變[21]。關(guān)于外泌體中的蛋白分子分選機制有3種途徑被提出。第1種是利用胞漿體系，比如ALIX和ESCRT蛋白以及LBPA[22-23]，ESCRT途徑可以募集ILV中單泛素化的蛋白進行胞內(nèi)溶酶體降解；第2種途徑是以富含鞘磷脂的細胞膜結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將細胞膜鑲嵌蛋白進行分離以及將脂閥上的flotilins和Tetraspanins蛋白及其結(jié)合蛋白共同分離到ILV中[24-25]；第3種途徑是由凝集素等因子在胞內(nèi)體腔內(nèi)發(fā)起的裝載，這一途徑主要是招募糖基化蛋白到外泌體中。但是Tau蛋白具體是通過什么方式被分選到外泌體中去的，其機制仍然不清楚，這也是下一步外泌體在Tau蛋白傳播中需要進一步研究的內(nèi)容。

綜上，神經(jīng)元可能在外泌體中分泌Tau的病原性形式，這種裝載有病原性蛋白的外泌體可以被神經(jīng)元攝取。這些證據(jù)表明包含Tau的外泌體在神經(jīng)元之間相互傳遞Tau，可能是大腦中Tau傳播的一個重要組成途徑。本研究通過經(jīng)典的超速離心結(jié)合超濾法成功分離獲得外泌體，并驗證了HEK293-Tau細胞的外泌體中存在Tau蛋白，但Tau蛋白是否能夠在細胞間通過外泌體傳播，有待進一步研究。