王鵬舉，黃世平，楊瑞瑞，曾幼玲

(新疆大學生命科學與技術學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊830046)

0 引 言

【研究意義】鹽漬化是影響植物生長、限制農作物產量的重要因素。鹽脅迫會引發(fā)一系列的氧化脅迫、滲透脅迫和離子脅迫，導致植物細胞膜損傷和細胞內滲透物質改變，使植物的生長受到影響。鹽生植物在進化過程中形成的獨特機制來調控對鹽脅迫的應答[1]，miRNA對靶基因的作用就是其中重要的調控途徑。microRNA作為一類非編碼內源小分子RNA，通過負調控相應的靶基因影響植物的生物學過程。鹽穗木(Halostachys caspica)廣泛分布于新疆鹽堿干旱地區(qū)，屬于藜科(Chenopodiaceae)極端耐鹽的鹽生灌木。microRNA作為一類非編碼內源小分子RNA，通過負調控相應的靶基因影響植物的生物學過程。鹽穗木(Halostachys caspica)廣泛分布于新疆鹽堿干旱地區(qū)，屬于藜科(Chenopodiaceae)極端耐鹽的鹽生灌木。研究鹽穗木miR393b及預測靶基因HcTIR1在高鹽脅迫條件下的表達模式與其二者的相關性，對于深入理解鹽穗木耐鹽分子功能和調控機制具有重要的意義。【前人研究進展】植物miRNA參與到各種生物進程中，如植物信號轉導、植物生殖和營養(yǎng)器官的生長發(fā)育和對各種生物和非生物脅迫的響應[2-4]，其在基因調控網(wǎng)絡中占有相當重要的地位[5]。鋁處理24h的植物亞麻，miR319、miR390和miR393的表達呈現(xiàn)下調[6]。miR393家族成員在大多數(shù)植物種中是比較保守的，其靶基因主要是轉錄因子堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(bHLH)以及生長素受體F-box(AFBauxinsignalingF-boxproteins)蛋白(TIR1、AFB1、AFB2和AFB3)。TIR1蛋白是植物中的生長素受體，轉基因擬南芥中TIR1的轉錄被miR393切割，miR393在ABA或滲透脅迫條件下抑制側根生長，通過表達TIR1可以消除這種抑制作用[7]。大豆TIR1和大豆AFB3介導的生長素信號，能促進大豆根瘤生長，表明大豆的TIR1和大豆AFB3在大豆的根瘤形成中起關鍵作用[8]。在硝酸鹽處理下，擬南芥miR393過表達，其靶基因AFB3的表達水平降低[9]。Luo等[10]在對玉米感染帶狀葉枯病后，檢測到玉米miR393b與預測靶基因TIR1的表達量呈負相關性，玉米miR393b表達下調，TIR1表達上調，生長素敏感性增強，玉米葉鞘發(fā)育受影響，推測靶基因TIR1通過激活生長素信號轉導途徑，以響應帶狀葉枯病脅迫，加強玉米的形態(tài)和代謝適應。miRNA海綿是一種用于體內高效抑制miRNA的方法，研究采用該技術構建了miR393(pBI-393-s)的miRNA海綿載體，在NaCl和ABA脅迫下，轉miR393海綿載體幼苗中TIR1的表達量比野生型的高，并且增強了轉基因擬南芥對鹽和ABA脅迫的耐受性；萌發(fā)率、根長、葉綠素含量皆高于野生型，miR393基因功能喪失植株耐鹽性增強，說明miR393基因對鹽敏感[11-12]。先前的研究表明，過表達miR393的轉基因植物對鹽和ABA處理比野生型植物敏感，Chen等[13]分別過表達miR393a、miR393b、mTIR1(競爭性miR393基因)和TIR1的突變體tir1的轉基因擬南芥株系，mTIR1基因的過量表達明顯增強了耐鹽性，提高了萌發(fā)率、降低離子運輸速率、減少了水分損失、抑制根系伸長、延緩衰老、降低死亡率、穩(wěn)定葉綠素含量，相反，miR393轉基因植株和TIR1突變體具有mTIR1植物相反的特性。水稻miR393響應鹽脅迫，過表達水稻OsmiR393植株比野生型對鹽堿脅迫更敏感[14]。在擬南芥外植體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，miR393a過表達時外植體芽的分化受到抑制，且將TIR1基因轉入擬南芥后恢復正常，用mTIR1基因抑制miR393a發(fā)揮作用，發(fā)現(xiàn)外植體芽的分化增強，miR393a和TIR1所發(fā)揮的功能相反，說明二者可能相互拮抗影響了外植體芽的分化[15]。植物miR393家族的表達隨不同環(huán)境和時間發(fā)生變化，如生長素信號轉導途徑，其預測靶基因TIR1響應非生物脅迫[16]。miR393和TIR1的表達具有一定的負相關性，miR393能增強植物對鹽脅迫的敏感性，相反，TIR1通過ABA信號轉導途徑和生長素信號轉導途徑增強植物的耐鹽性，并參與了生長發(fā)育過程?！颈狙芯壳腥朦c】鹽穗木(Halostachys caspica)是在極端鹽堿干旱環(huán)境下生長的高度肉質化多年生藜科(Chenopodiaceae)鹽生灌木。miR393b響應鹽脅迫，在高鹽脅迫鹽穗木根的小RNA文庫中表現(xiàn)上調?！緮M解決的關鍵問題】研究以新疆鹽生植物鹽穗木為研究材料，采用生物信息學方法預測鹽穗木miR393b的靶基因，通過qRT-PCR方法檢測鹽脅迫下鹽穗木miR393b及預測靶基因HcTIR1的相對表達模式，二者呈現(xiàn)一定的負相關性，對于深入理解鹽穗木耐鹽分子功能和調控機制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

鹽穗木種子采集于新疆古爾班通古特沙漠邊緣，種子種植于花盆于溫室中培養(yǎng)(溫度25℃左右，光照時間16h/d，34μmol/(m2·s)。植株生長到約90d，進行400、600mmol/LNaCl鹽脅迫分別處理0、3、6、12、24、48、72h(自來水澆灌的鹽穗木作為對照)，收獲鹽穗木的同化枝作為樣品。不同處理樣品三個生物學重復。將所有采集的樣品收集后，立即放入液氮中冷凍并保存至-80℃冰箱，用于后續(xù)real-timePCR檢測實驗。

1.2 方 法

1.2.1RNA提取

總RNA的提取步驟參照天根PlantTotalRNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.2cDNA的合成與熒光定量

利用polyA加尾法對totalRNA進行反轉錄合成cDNA。按照TaKaRa公司SYBR?PrimeScriptTMmiRNART-PCRKit進行miRNA的熒光定量實驗。

按照M-MLVReverseTranscriptase試劑盒(TaKaRa)和Oligo(dT)18primer等反轉錄試劑合成cDNA用于定量分析。按照SYBR?SelectMasterMix(AppliedBiosystems)操作說明進行靶基因的熒光定量試驗。表1

HcmiR393b的檢測以5SrRNA為內參，HcTIR1以β-actin為內參，使用ABI7 500熒光定量PCR儀獲得實驗數(shù)據(jù)及使用2-△△ct法分析數(shù)據(jù), 并利用軟件Prism5.0作圖，分析鹽穗木miR3 93b及預測靶基因HcTIR1在鹽脅迫下的表達模式。

表1 所用引物序列
Table1Primersequencesusedintheexperiments

名稱 Name引物Primer 引物序列(5’-3’) Primer sequence(5’-3’)miR393bGGTCCAAAGGGATCGCATTGATTTHcTIR1-P1GCCGAAAATCGCCCTAACCTAHcTIR1-P2ACCAATAATGCTCTCCCACCAqRT-PCRHc5S rRNA-P1ACCCGATCCCATTCCGACHc5S rRNA-P2TGTCTCCCGAACAATCTCAGTACHcβ-actin-P1AAGATCTGGCACCACACCTTCHcβ-actin-P2CACACCATCACCAGAATCGA

2 結果與分析

2.1 鹽穗木miR393b成熟體序列比對及預測靶基因的靶向預測

從前期獲得的600 mmol/L NaCl處理48 h鹽穗木根的小RNA文庫中,篩選獲得表達顯著差異的基因miR393b，比對雙子葉不同科植物鹽穗木、擬南芥、蘋果、菊芋等和單子葉不同科植物水稻和蘆筍的miR393b的序列結果表明miR393b在不同植物種中高度保守(圖1A)。

利用植物miRNA與其靶基因之間的高度互補性可以有效預測miRNA的靶基因[17-18]。利用鹽穗木轉錄組數(shù)據(jù)預測到miR393b可能的靶基因HcTIR1(圖1B)，HcTIR1基因可能受到miR393b調控。圖1

圖1 鹽穗木miR393b成熟體與相應的不同植物中miR393b的比對(A)及靶基因預測(B)
Fig.1 Alignment ofH.caspicamiR393b with those of different plant species (A) and prediction of target gene with its transcriptome data(B)

2.2 鹽脅迫處理鹽穗木miR393b與預測靶基HcTIR1的表達模式

分析鹽穗木miR393b與其預測靶基因HcTIR1在高鹽條件下的表達模式和相關性，實施了RNA水平的基因表達real-time PCR實驗。研究表明，400和600 mmol/L NaCl不同鹽濃度處理下，鹽穗木同化枝miR393b和預測靶基因HcTIR1的表達呈現(xiàn)相似的趨勢，miR393b隨著脅迫時間的延長表現(xiàn)先下降后升高的趨勢，HcTIR1表達大致呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其二者的基因表達負相關性在600 mmol/L NaCl 高鹽處理表現(xiàn)更為明顯。圖2

圖2 400和600 mmol/L鹽脅迫處理鹽穗木同化枝miR393b及其預測靶基因HcTIR1的相對表達(A、B和C、D)和相關性(3 h(E)和48 h(F))
Fig.2 Expression pattern (A, B and C, D) and correlation (3 h (E) and 48 h (F)) ofH.caspicabranch miR393b and predictive target geneHcTIR1 under the treatment of 400 and 600 mmol/L NaCl stress

3 討 論

鹽脅迫是限制植物生長發(fā)育的一類環(huán)境限制因子。植物在生長過程中受到不同逆境脅迫時，能夠上調或下調miRNA或者其預測靶基因的表達。某些miRNA的一些靶基因能夠映射到與鹽脅迫相關的通路上，例如鈣離子信號通道、MAPK信號通路、植物激素信號轉導、類黃酮合成、泛素介導的蛋白降解途徑、凋亡途徑、ABC轉運子、peroxisome、DNA損傷[19-22]。TIR1就是一類映射到植物激素信號轉導通路中的關鍵基因，在鹽脅迫下，擬南芥miR393對TIR1生長素受體有負調控作用，導致生長素信號通路受阻，從而抑制幼苗的生長[23]。

miRNA作為一種轉錄后調控因子，其在表達上具有時序性、組織特異性和脅迫濃度的依賴性[24-25]。Iglesias等研究表明，擬南芥在受到鹽脅迫時通過加強擬南芥miR393a突變體的轉錄提高植物中的突變體基因的表達量，其靶基因TIR1和AFB2等[26]生長素受體的含量被抑制，突變體轉基因擬南芥對鹽脅迫的耐受性增強。通過不同鹽濃度不同時間處理鹽穗木，其同化枝中miR393b與預測靶基因HcTIR1的表達模式和相關性的分析結果顯示,兩基因的表達在高鹽脅迫下響應鹽脅迫，并且呈現(xiàn)良好的負相關性，推測鹽穗木miR393b及其預測靶基因HcTIR1可能參與鹽脅迫的過程。

生長素是植物體內重要的內源激素，參與到植物生長和發(fā)育的諸多過程。miR393作為植物激素信號轉導通路上一個重要的調控因子，有報道也參與到逆境響應的通路中，探討鹽生植物鹽穗木miR393b與預測靶基因HcTIR1在耐鹽中的作用，為解析和豐富鹽穗木的耐鹽機理具有理論意義。

4 結 論

鹽穗木是一種極端耐鹽莖葉高度肉質化的藜科鹽生植物。從高鹽脅迫鹽穗木根的小RNA文庫中篩選獲得表達顯著上調的基因miR393b，從鹽穗木轉錄組數(shù)據(jù)庫中生物信息學預測到其靶基因為HcTIR1(transportinhibitorresponse1)；不同植物種的成熟體miR393b序列具有很高的同源性；qRT-PCR的結果顯示,鹽穗木miR393b和預測的靶基因HcTIR1二者均響應高鹽脅迫且呈現(xiàn)負相關性，隨著鹽脅迫濃度的升高，其負相關性更明顯。