梅 闖，閆 鵬，艾沙江·買(mǎi)買(mǎi)提，朱燕飛，馬 凱，韓立群，王繼勛

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹(shù)科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆野蘋(píng)果(Malussieversii)，分布于天山山脈，同源性高且最原始[1]，其花、果實(shí)、營(yíng)養(yǎng)成分、生長(zhǎng)習(xí)性具有豐富的多樣性[2]，遺傳基因豐富可促進(jìn)蘋(píng)果品種的選育[3]。蘋(píng)果小吉丁蟲(chóng)(AgrilusmaliMats.)，屬鞘翅目，是蘋(píng)果毀滅性鉆蛀害蟲(chóng)，其幼蟲(chóng)隱藏于樹(shù)干或枝干皮層內(nèi)盤(pán)旋蛀食，致使木質(zhì)部和韌皮部分離，造成枝干枯死，為害嚴(yán)重時(shí)造成果樹(shù)整株死亡[4]。中國(guó)多省份零星分布為害，1995年在新疆發(fā)現(xiàn)，并入侵至天山野果林，快速繁殖并最終暴發(fā)成災(zāi)[5]，被我國(guó)定為高度危險(xiǎn)有害生物，該蟲(chóng)害枯死野蘋(píng)果達(dá)到600多公頃[6]。栽培蘋(píng)果是世界上最重要的水果之一，具有自交不親和，無(wú)性繁殖的特點(diǎn)[7]，這些特征導(dǎo)致新疆野蘋(píng)果重要基因消亡后，將不可再生。研究新疆野蘋(píng)果次生代謝物對(duì)蟲(chóng)害脅迫的響應(yīng)，對(duì)保護(hù)利用新疆野蘋(píng)果資源有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲(chóng)取食寄生植物后，會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)性的抗蟲(chóng)響應(yīng)，表現(xiàn)為受損植物細(xì)胞信號(hào)輸入，隨后進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(鈣離子通量，磷酸化級(jí)聯(lián)和激素串?dāng)_)和信號(hào)處理(轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組和代謝組的重構(gòu))，隨后發(fā)生信號(hào)響應(yīng)(防御化合物，蛋白質(zhì)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生)[8, 9]。次生代謝物質(zhì)是復(fù)雜的分支代謝途徑產(chǎn)物，不直接參與維持植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖有關(guān)的基礎(chǔ)生化活動(dòng)，但可作為信號(hào)分子，或直接參與化學(xué)防御，包括酚類(lèi)化合物、萜類(lèi)化合物、含氮有機(jī)堿類(lèi)化合物、硫代葡萄糖苷等[10]。同時(shí)可以利用植物自身的防御代謝物質(zhì)合成植物源殺蟲(chóng)劑消滅害蟲(chóng)[11]。擬南芥中研究表明，硫代葡萄糖苷構(gòu)成了植物-昆蟲(chóng)互作主要的防御性狀，作為對(duì)昆蟲(chóng)取食的響應(yīng)，MYR催化硫代葡萄糖苷的氰基化以釋放毒性化合物，例如，腈，異硫氰酸酯和硫氰酸甲酯[12]。柳枝稷在受到蚜蟲(chóng)侵染后，其體內(nèi)的ROS和多種次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)生顯著變化，并伴隨著NAC，WRKY和MYB轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)表達(dá)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，不同品系楊樹(shù)咖啡酸、肉桂酸、丁香酸對(duì)青楊脊虎天牛(Xylotrechusrusticus)的驅(qū)避效果明顯[14]。另外黃酮類(lèi)物質(zhì)也對(duì)昆蟲(chóng)有毒性，可以影響昆蟲(chóng)的行為和代謝，或破壞昆蟲(chóng)的正常代謝過(guò)程，對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖均有明顯的抑制作用[15]。【本研究切入點(diǎn)】研究新疆野蘋(píng)果受到蟲(chóng)害誘導(dǎo)前后某些次生代謝物質(zhì)的變化情況及其產(chǎn)生規(guī)律?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以經(jīng)過(guò)前期鑒定穩(wěn)定遺傳的抗蟲(chóng)株系為材料，利用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)，定性定量測(cè)定次生代謝物質(zhì)含量變化趨勢(shì)，研究新疆野蘋(píng)果(Malussieversii)受到蟲(chóng)害脅迫誘導(dǎo)后相關(guān)次生代謝物質(zhì)的變化及其產(chǎn)生規(guī)律，為保護(hù)利用新疆野蘋(píng)果資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2011～2016年在實(shí)地調(diào)查新疆新源縣蘋(píng)果小吉丁蟲(chóng)疫區(qū)新疆野蘋(píng)果資源，總計(jì)調(diào)查面積2 500余hm2，新疆野蘋(píng)果受蘋(píng)果小吉丁蟲(chóng)危害嚴(yán)重(干枯死枝率達(dá)到90%以上)，同海拔同一地點(diǎn)有5株新疆野蘋(píng)果受害較輕(干枯死枝率低于10%，且枝干生長(zhǎng)旺盛)[16]從表型性狀分析該類(lèi)單株可能具備一定的抗蟲(chóng)能力，選定一株為害等級(jí)最低植株定為抗蟲(chóng)株系[6]。在具有抗蟲(chóng)株系新疆野蘋(píng)果周邊選取1株具有代表性的受侵害單株作為對(duì)照株系，樹(shù)齡在45～60 a?；趶V泛靶向代謝組技術(shù)平臺(tái)的代謝分析，檢測(cè)分析16個(gè)抗蟲(chóng)代謝物，對(duì)代謝物的定量和差異分析，揭示新疆野蘋(píng)果在不同處理?xiàng)l件下抗蟲(chóng)代謝物的代謝機(jī)制。表1

表1 檢測(cè)代謝物種類(lèi)及數(shù)量
Table 1 Detecting the type and quantity of metabolites

ID英文名稱(chēng)English name中文名稱(chēng)Chinese NameMas01Theophylline茶堿Mas02Syringic acid丁香酸Mas03Chlorogenic acid綠原酸Mas04Vanillic acid香草酸Mas05Ferulic acid阿魏酸Mas06Caffeic acid咖啡酸Mas07p-Coumaric acid4-香豆酸Mas08Benzoic acid苯甲酸Mas09Quercetin3-O-a-L-rhamnoside (Quercitrin)槲皮素 3-O-鼠李糖苷 (槲皮苷)Mas10Quercetin槲皮素Mas11aloperine苦豆堿Mas12Theobromine咖啡堿Mas13Gramine蘆竹堿Mas14Salicylic acid (SA)水楊酸Mas15trans-Cinnamic acid反式肉桂酸Mas16Rutin蕓香甙

1.2 方 法

1.2.1 侵染處理

根據(jù)昆蟲(chóng)危害習(xí)性，蘋(píng)果小吉丁蟲(chóng)寄生于蘋(píng)果枝條韌皮部，蟲(chóng)卵于上一年產(chǎn)于韌皮部，次年5月幼蟲(chóng)開(kāi)始為害，至7月為高峰，持續(xù)到9月。選擇經(jīng)過(guò)多年鑒定，抗蟲(chóng)表現(xiàn)穩(wěn)定的新疆野蘋(píng)果單株。根據(jù)蘋(píng)果小吉丁蟲(chóng)生育期，分別對(duì)兩種處理進(jìn)行幼蟲(chóng)侵染(模擬幼蟲(chóng)孔道，接入成齡幼蟲(chóng))，采集樣品，分別是侵染后10 d(機(jī)械傷害愈合且接入幼蟲(chóng)取食距傷口>3 cm處)，采集抗蟲(chóng)株系與對(duì)照株系的健康部位和侵染部位韌皮部50 g，立即在液氮中冷凍并儲(chǔ)存在-80℃冰箱中，每個(gè)株系3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)12個(gè)樣品。

1.2.2 樣品提取

取出超低溫冷凍保存的生物材料樣本，利用研磨儀(MM 400, Retsch)在30Hz條件下研磨1 min，稱(chēng)取100 mg的粉末，利用80%甲醇1.0 mL于4℃提取過(guò)夜，期間渦旋3次，使提取更為充分。提取后，12 000 g離心15 min，吸取上清，35℃加熱模式下氮?dú)獯蹈桑?00 μL 30%甲醇水復(fù)溶樣品，渦旋使目標(biāo)物質(zhì)充分溶解，12 000 g離心15 min，吸取上清，并保存在進(jìn)樣瓶中用于LC-MS分析。

1.2.3 色譜質(zhì)譜采集條件

參照Pan、Francescato和Wojakowska[17-19]的方法，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)分析方法測(cè)定次生代謝物含量。所有的化學(xué)試劑都是分析純或色譜純的制劑?；瘜W(xué)標(biāo)準(zhǔn)品從BioBioPha公司(http://www.biobiopha.com/)與美國(guó)Sigma-Aldrich公司購(gòu)買(mǎi)(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)。分析條件主要包括：(1)色譜柱：WatersACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm ×100 mm。(2)流動(dòng)相：水相為超純水(加入0.1%的甲酸)，有機(jī)相為乙腈(加入0.1%的甲酸)；(3)洗脫梯度，水：乙腈，0 min為95∶5 V/V，11.0 min為5∶95 V/V，12.0 min為5∶95 V/V，12.1 min為95∶5 V/V，15.0 min為95∶5 V/V；(4)流速為0.4 mL/min；(5)柱溫為40℃；(6)進(jìn)樣量為5 μL。樣品經(jīng)過(guò)色譜分離后進(jìn)入到質(zhì)譜進(jìn)行分析。

配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行質(zhì)譜分析，其中，標(biāo)準(zhǔn)品濃度包括0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL等。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析(P<0.05)及標(biāo)準(zhǔn)誤的計(jì)算。繪圖用 origin 8.5 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆野蘋(píng)果自然條件下次生代謝組分差異

研究表明，此次靶向代謝檢測(cè)分為四個(gè)大類(lèi)，分別是羥基肉桂酰衍生物(圖1-A)、生物堿(圖1-B)、黃酮醇(圖1-C)和其它物質(zhì)(圖1-D)。

羥基肉桂酰衍生物中對(duì)照株系香豆酸含量顯著高于抗蟲(chóng)株系，含量分別為2.2×104和0.5×104μg/mL，差異倍數(shù)達(dá)到4.4。丁香酸含量高于抗蟲(chóng)株系42.3%，未達(dá)到顯著差異。其中反式肉桂酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸含量變化不大；生物堿含量中，抗蟲(chóng)株系普遍低于對(duì)照株系，其中苦豆堿含量最低，分別是3.9×103和3.1×103μg/mL，咖啡堿含量最高，達(dá)到1.1×106和9.5×105μg/mL，對(duì)照株系高于抗蟲(chóng)株系16.9%。蘆竹堿和茶堿含量差異均不顯著。

黃酮醇含量測(cè)定中，各組分含量呈現(xiàn)不同差異變化趨勢(shì)，其中抗蟲(chóng)株系的蕓香苷含量顯著高于對(duì)照株系，含量分別為9.8×106和4.4×106μg/mL，差異倍數(shù)為2.3?？瓜x(chóng)株系的榭皮苷含量高于對(duì)照株系，分別達(dá)到2.5×107和2.1×107μg/mL；在檢測(cè)的其它組分中，差異均不顯著，其中綠原酸含量最高，苯甲酸含量最低。圖1

注:Ch:對(duì)照株系健康部位。Rh：抗蟲(chóng)株系健康部位

Note:Ch: Healthy parts of control strains. Rh: Healthy parts of insect-resistant strains

圖1 新疆野蘋(píng)果自然條件下次生代謝組分差異
Fig. 1 Differences of the secondary metabolites in Xinjiang wild apple under normal conditions

2.2 新疆野蘋(píng)果蟲(chóng)害侵染條件下次生代謝組分對(duì)蟲(chóng)害脅迫的響應(yīng)

研究表明，抗蟲(chóng)株系與對(duì)照株系在被小吉丁蟲(chóng)侵染處理后，羥基肉桂酰衍生物中的反式肉桂酸含量上升明顯，達(dá)到極顯著水平，含量分別為3.3×104和2.2×106μg/mL，差異倍數(shù)為6.8。同時(shí)抗蟲(chóng)株系的咖啡酸含量極顯著高于對(duì)照株系，提升倍數(shù)為3.8。此外，阿魏酸含量也顯著上升，含量分別為4.5×104和5.3×104μg/mL(圖2-A)。由此可見(jiàn)，變化明顯的大多屬于羥基肉桂酰衍生物一大類(lèi)，說(shuō)明抗蟲(chóng)植株在受到蟲(chóng)害脅迫后，激發(fā)植物體自身調(diào)節(jié)變化，提高羥基肉桂酰衍生物次生代謝含量以抵御侵害；生物堿組分含量測(cè)定中，蟲(chóng)害侵染處理后，各組分均沒(méi)有達(dá)到顯著差異水平，其中咖啡堿含量最高，對(duì)照株系高于抗蟲(chóng)株系，含量為9.7×105和7.1×105μg/mL，差異倍數(shù)為1.4，苦豆堿含量最低(圖2-B)。

黃酮醇類(lèi)組分中，對(duì)照株系榭皮素含量顯著高于抗蟲(chóng)株系，達(dá)到44.3%，榭皮苷與蕓香苷含量在蟲(chóng)害侵染前后變化差異不明顯，但榭皮苷含量在黃酮醇類(lèi)組分中最高，分別為2.4×107和2.3×107μg/mL；在其它組分含量測(cè)定中，苯甲酸、綠原酸、水楊酸對(duì)蟲(chóng)害脅迫響應(yīng)明顯，均有不同程度的提高，其中水楊酸上升達(dá)到顯著水平。圖2

注:Cuh:對(duì)照株系侵染部位。Ruh：抗蟲(chóng)株系侵染部位

Note:Cuh: Infection site of control strain. Ruh: Infection site of insect-resistant strains

圖2 新疆野蘋(píng)果蟲(chóng)害侵染后次生代謝組分的響應(yīng)
Fig. 2 Response of secondary metabolites after pest infestation in Xinjiang wild apple

3 討 論

植物的次生代謝產(chǎn)物非常豐富，根據(jù)成分，主要分為萜類(lèi)、生物堿、苯丙烷類(lèi)和相關(guān)苯基化合物四大類(lèi)[20]，植物受到蟲(chóng)害侵染后，會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，從而產(chǎn)生相關(guān)萜類(lèi)化合物，組織防御體系[21]，研究認(rèn)為，在自然條件下，測(cè)定健康部位羥基肉桂酰衍生物、生物堿、黃酮醇及其它代謝物質(zhì)變化差異不明顯。在蟲(chóng)害脅迫條件下反式肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、水楊酸含量均顯著上升，說(shuō)明這些代謝物對(duì)蟲(chóng)害脅迫產(chǎn)生積極響應(yīng)。此外，酚類(lèi)物質(zhì)、單寧、生物堿與蛋白質(zhì)及酶作用，形成不易消化的復(fù)合物，影響昆蟲(chóng)消化率及攝食量[22]。苯丙烷類(lèi)途徑可生成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香豆素、綠原酸，也可形成反式香豆酰輔酶A酯，再通過(guò)多條途徑進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素、黃酮、異黃酮、生物堿、苯甲酸酯糖苷等次生代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物對(duì)昆蟲(chóng)具有一定的毒害與防御作用[23]。興安落葉松受損后其葉內(nèi)單寧含量呈顯著增加的趨勢(shì)，北美云杉(Piceasitchensis) 和多葉羽扇豆(Lupinuspolyphyllus) 在受到傷害后，創(chuàng)傷樹(shù)脂和生物堿的含量分別增加[24, 25]。與此同時(shí)許多酚酸對(duì)害蟲(chóng)威懾非常有效，是許多具有傳遞抗性的復(fù)合分子前體[26]。通過(guò)代謝組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析二化螟對(duì)水稻的響應(yīng)機(jī)制認(rèn)為，莽草酸、糖代謝、氨基酸、有機(jī)酸和萜類(lèi)代謝等途徑共同參與了水稻抗蟲(chóng)性調(diào)控過(guò)程[27]。這與研究結(jié)果相似，即新疆野蘋(píng)果受蟲(chóng)害脅迫逆境條件下，通過(guò)調(diào)節(jié)自身免疫系統(tǒng)，造成植物“自身抗蟲(chóng)”的表型。

植物在受到昆蟲(chóng)危害后的防御反應(yīng)是多維的動(dòng)態(tài)過(guò)程，包含的層次與功能相對(duì)復(fù)雜[25]，植物與昆蟲(chóng)互作機(jī)理研究通常會(huì)使用高通量組學(xué)技術(shù)(轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)等)揭示其抗性產(chǎn)生機(jī)理[28]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析并鑒定候選基因，了解植物在生物脅迫和非生物脅迫過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)[29-31]。蘋(píng)果小吉丁蟲(chóng)是新疆野蘋(píng)果這一“起源種”的毀滅性蟲(chóng)害，進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)錄組、代謝組和生理水平研究新疆野蘋(píng)果抗蘋(píng)果小吉丁蟲(chóng)的生理生化響應(yīng)機(jī)理、轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制以及如何增強(qiáng)抗蘋(píng)果小吉丁蟲(chóng)功能是接下來(lái)重點(diǎn)擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。為有效保護(hù)、利用新疆野蘋(píng)果這一珍貴資源提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

新疆野蘋(píng)果在被蘋(píng)果小吉丁蟲(chóng)侵染后反式肉桂酸含量極顯著提高，含量分別為3.3×104和2.2×106μg/mL，差異倍數(shù)為6.8?？Х人?、綠原酸、槲皮素、阿魏酸組分含量顯著提高，且上升明顯的次生代謝物大多屬羥基肉桂酰衍生物一大類(lèi)，抗蟲(chóng)植株在受到蟲(chóng)害脅迫后，此類(lèi)代謝物質(zhì)產(chǎn)生積極響應(yīng)，激發(fā)植物體自身調(diào)節(jié)變化，提高羥基肉桂酰衍生物等次生代謝含量。