樊夏輝，劉桂禮，孔全存,2，李 勇，王志強，鐘 昊，徐 濤

(1.北京信息科技大學(xué)儀器科學(xué)與光電工程學(xué)院，北京 100192；2．清華大學(xué)機械工程系，精密/超精密制造裝備及 控制北京市重點實驗室，北京 100084；3.清華大學(xué)天津高端裝備研究院，天津 300300)

0 引言

基于即時檢驗(point-of-care testing，POCT)的微流控技術(shù)具有樣品消耗少、檢測速度快及體積小等優(yōu)點[1]。免疫熒光檢測是微流控技術(shù)應(yīng)用的主要手段之一[2]，而微流控芯片是實現(xiàn)便攜式免疫熒光檢測、即時檢驗的重要平臺之一，其主要檢測方式為利用光電探測器掃描測量微流控芯片流道上的熒光，以檢測區(qū)與質(zhì)檢區(qū)掃描信號的面積之比表示檢測結(jié)果[3]。為實現(xiàn)小型化和低成本，誘導(dǎo)熒光的光源采用LED(light emitting diode)[4]，但在掃描過程中LED光源的不穩(wěn)定性，易導(dǎo)致檢測區(qū)和質(zhì)檢區(qū)熒光信號采集的同步實時性變差，在很大程度上影響了檢測精度和穩(wěn)定性，故光源補償對微流控芯片的免疫熒光檢測至關(guān)重要。

現(xiàn)有的LED光源補償方法主要有時間法、光強調(diào)制法、參數(shù)模型法和實時監(jiān)測法等。時間法是通過一定的啟動時間(數(shù)十min)補償光源，使其達(dá)到平衡穩(wěn)定[5]，但啟動時間較長，且對工作環(huán)境的要求較高。光強調(diào)制法是根據(jù)光強波動調(diào)整其驅(qū)動信號，提高了光源的穩(wěn)定性，且無需較長的啟動時間[6-7]，但驅(qū)動信號的調(diào)整時間間隔(數(shù)min)較長，檢測的同步實時性受限。參數(shù)模型法是建立光源的光強與驅(qū)動電流、工作溫度等參數(shù)之間的非線性數(shù)學(xué)模型，以補償光源，提高了其在復(fù)雜環(huán)境下的穩(wěn)定性[8-10]，但不同光源之間存在差異性，難以用一個統(tǒng)一的模型表達(dá)。實時監(jiān)測法是設(shè)置并監(jiān)測參考光，根據(jù)參考光與檢測結(jié)果之間的線性關(guān)系，將檢測結(jié)果歸一化，以避免光源的漂移特性和不同光源之間的差異性對檢測結(jié)果的影響，提高其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[11-13]，但對應(yīng)點信號采集的時間延遲會引入誤差和環(huán)境噪聲干擾顯著。

綜上所述，現(xiàn)有補償方法難以同時滿足免疫熒光檢測的同步實時性好、抗干擾性好及魯棒性高等要求。因此，本文通過分析LED光源的漂移特性，引入光源時變補償因子，提出并實現(xiàn)一種基于光源漂移特性的自適應(yīng)補償方法，并搭建高精度免疫熒光檢測實驗裝置，開展對比實驗，進(jìn)行誤差分析，驗證其應(yīng)用可行性。

1 基于光源漂移特性的自適應(yīng)補償方法

1.1 光路結(jié)構(gòu)和微流控芯片

免疫熒光檢測的光路結(jié)構(gòu)分為非共聚焦和共聚焦，共聚焦相比于非共聚焦具有分辨率高、噪聲小等優(yōu)點[14]，本文以共聚焦式免疫熒光檢測為研究對象。

如圖1所示，LED發(fā)射出來的光，經(jīng)聚光透鏡減小發(fā)散角和濾光片濾除雜散光，再由二向色鏡分為激發(fā)光和監(jiān)測光，監(jiān)測光被聚焦至監(jiān)測光探測器，激發(fā)光經(jīng)過下部聚焦透鏡聚焦，對微流控芯片的流道進(jìn)行掃描并產(chǎn)生熒光，熒光由下部聚焦透鏡捕獲后變成平行光，通過二向色鏡和濾光片，濾除熒光以外的雜散光，被上部聚焦透鏡聚焦至熒光探測器。其中，微流控芯片主要由加樣腔、流體調(diào)節(jié)器、流道、檢測區(qū)、質(zhì)檢區(qū)和廢液倉等部件組成，掃描過程為“流道-檢測區(qū)-流道-質(zhì)檢區(qū)-流道”，被測物位于檢測區(qū)，而質(zhì)檢區(qū)為參考物以保證微流控芯片的有效性[15]。記光源強度為P(mW)，監(jiān)測光強度為Q(mW)，激發(fā)光強度為I(mW)，熒光強度為F(mW)，二向色鏡的反射率為m。

圖1 共聚焦式免疫熒光檢測光路結(jié)構(gòu)和微流控芯片

在共聚焦光路中，激發(fā)光和監(jiān)測光分別為光源經(jīng)過二向色鏡的反射光和透射光，則光源、激發(fā)光、監(jiān)測光滿足式(1)和式(2)：

P=I+Q

(1)

I=mP

(2)

根據(jù)理論分析，LED光源隨時間以自然常數(shù)e為底的負(fù)指數(shù)形式衰減，則以式(3)擬合光源的漂移特性。

P=ke-λt+b

(3)

式中：k、λ、b為擬合系數(shù)。

1.2 免疫熒光檢測中存在的問題

在微流控芯片免疫熒光檢測中，通常以檢測區(qū)和質(zhì)檢區(qū)的掃描信號面積之比表示檢測結(jié)果。記檢測區(qū)掃描信號的起始和結(jié)束時間分別為t1、t2，質(zhì)檢區(qū)掃描信號的起始和結(jié)束時間分別為t3、t4，檢測結(jié)果為S，則

(4)

然而，光源不穩(wěn)定導(dǎo)致檢測區(qū)和質(zhì)檢區(qū)熒光信號采集的同步實時性較差和檢測的一致性較差，如圖2所示，在掃描過程中，LED光源隨時間逐漸衰減，使得檢測區(qū)和質(zhì)檢區(qū)的熒光信號在不同時間和不同的光強激發(fā)下被采集，即同步實時性難以保證；第ni次和nj次(i，j=1,2,3，……；i≠j)檢測的光源漂移特性擬合系數(shù)k、λ和b是不同的，即當(dāng)工作環(huán)境和光源不同(不同工作環(huán)境之間和不同光源之間存在差異性)時，光源的漂移特性呈現(xiàn)出差異性，對檢測的一致性影響較大。

1.3 光源時變補償因子及自適應(yīng)補償

微流控芯片上的被測物或參考物一般為稀溶液(真菌或病毒感染時，其濃度一般較低)，由朗伯-比爾定律可知[16]，熒光與激發(fā)光滿足式(5)。

F=2.3φIεlC

(5)

式中：φ為熒光染料的熒光量子產(chǎn)率，%；ε為熒光染料的摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm)；l為微流控芯片流道的厚度，cm；C為微流控芯片上被測物或參考物中熒光物質(zhì)的濃度，mol/L。

根據(jù)式(4)和式(5)可知，微流控芯片的檢測結(jié)果S為

(6)

式中：CT為檢測區(qū)被測物中熒光物質(zhì)的濃度，mol/L；CC為質(zhì)檢區(qū)參考物中熒光物質(zhì)的濃度，mol/L。

將式(1)、式(2)和式(3)帶入式(6)，可得：

(7)

(8)

通過式(8)使得微流控芯片的檢測結(jié)果與時間、光源強度無關(guān)，實現(xiàn)對光源的自適應(yīng)補償。其中，光源時變補償因子α以光源的漂移特性為依據(jù)，消除在掃描過程中光源衰減對檢測結(jié)果的影響，保證檢測區(qū)和質(zhì)檢區(qū)熒光信號采集的同步實時性；光源時變補償因子α與擬合系數(shù)k、λ、b密切相關(guān)，當(dāng)工作環(huán)境和光源改變致使k、λ、b發(fā)生變化時，α也隨之改變，即光源時變補償因子α具有自適應(yīng)性，能夠順應(yīng)光源和工作環(huán)境的改變，以抵消擬合系數(shù)k、λ、b的變化，避免光源漂移特性的差異性對檢測結(jié)果的影響，有效提高免疫熒光檢測的一致性、抗干擾性和魯棒性。

2 實驗與討論

2.1 實驗裝置

為實現(xiàn)微流控芯片高一致性、高穩(wěn)定性檢測，本文搭建了高精度共聚焦式免疫熒光檢測實驗裝置，主要由熒光探測器、監(jiān)測光探測器、共聚焦光路、電動位移臺及運動控制與數(shù)據(jù)采集單元等組成，如圖3所示。

(a)運動控制與數(shù)據(jù) 采集單元 (b)共聚焦檢測模塊圖3 共聚焦式免疫熒光檢測實驗裝置

熒光探測器和監(jiān)測光探測器為光電二極管模塊，其分辨率為0.01 nW，靈敏度為300 mV/nW。標(biāo)記被測物和參考物的熒光染料為CY5，其具有高分辨率、高靈敏度及低成本等優(yōu)點。根據(jù)CY5的激發(fā)峰值波長為648 nm和發(fā)射峰值波長為666 nm，共聚焦光路中的光源選用功率為3 W和峰值波長為630 nm的LED，濾光片組由(625±30)nm的激發(fā)濾光片、(670±10)nm的發(fā)射濾光片和中心波長為650 nm的二向色鏡等組成。電動位移臺的分辨率為0.5 μm，其定位精度為2 μm。

2.2 LED光源漂移特性實驗

在不同的LED光源和工作環(huán)境下，保持光源與監(jiān)測光探測器相對位置不變，啟動光源，每相隔1 min記錄監(jiān)測光探測器的輸出，每次監(jiān)測35 min，并擬合監(jiān)測數(shù)據(jù)，共進(jìn)行50組實驗。

圖4為典型的6組LED光源監(jiān)測數(shù)據(jù)及其擬合曲線，表1為典型的12組LED光源漂移特性的擬合系數(shù)。由圖4和表1可知，當(dāng)光源啟動后，其漂移特性與以自然常數(shù)e為底的負(fù)指數(shù)函數(shù)相符合，最大擬合偏差為0.007 V，擬合相關(guān)性達(dá)到99.3%以上；當(dāng)工作環(huán)境和光源不同時，擬合系數(shù)k、λ、b不同，光源的漂移特性具有差異性，光源時變補償因子α能夠順應(yīng)其漂移特性的變化，對光源進(jìn)行自適應(yīng)補償。

圖4 LED光源監(jiān)測及其擬合曲線

表1 LED光源漂移特性的擬合系數(shù)

2.3 微流控芯片免疫熒光檢測實驗

常用于免疫熒光檢測的標(biāo)志物有降鈣素原、心型脂肪酸結(jié)合蛋白、D-二聚體及C反應(yīng)蛋白等，檢測范圍分別為0.1～50、1～120、0.1～10、0.5～200 μg/mL[17]。其中，降鈣素原是診斷和監(jiān)測嚴(yán)重細(xì)菌性炎癥和真菌感染的重要參數(shù)之一，其參考值為0.5 ng/mL，檢測分辨率要求較高，若能夠?qū)碘}素原準(zhǔn)確、穩(wěn)定地實現(xiàn)檢測，則其他亦可被輕易檢出，故本文以降鈣素原為例進(jìn)行免疫熒光檢測實驗，具有實驗代表性。

在不同的LED光源和工作環(huán)境下，利用實驗裝置分別檢測降鈣素原濃度為0.25、0.33、0.46、0.91、1.67 ng/mL的微流控芯片，每個芯片檢測25次，記錄補償前和補償后的檢測結(jié)果。

圖5為補償前后免疫熒光檢測實驗對比，表2為補償前后免疫熒光檢測誤差對比。其中，最大偏差為檢測結(jié)果與標(biāo)稱濃度的最大差值， CV值(離散系數(shù)，coefficient of variation)為每個芯片所有檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差與平均值之比，反映了檢測的精密度。由圖5和表2可知，補償前檢測的最大偏差為0.06 ng/mL，CV值小于0.53%，補償后檢測的最大偏差為0.01 ng/mL，CV值小于0.25%，則免疫熒光檢測經(jīng)過光源自適應(yīng)補償后，其一致性、抗干擾性和魯棒性得到有效提高，檢測分辨率達(dá)到0.01 ng/mL，CV值提高約50%。

圖5 補償前后免疫熒光檢測實驗對比

表2 補償前后免疫熒光檢測誤差對比

3 結(jié)束語

為提高免疫熒光檢測的一致性、抗干擾性和魯棒性，實現(xiàn)微流控芯片高精度、高穩(wěn)定性檢測，本文提出并實現(xiàn)了一種基于LED光源漂移特性的自適應(yīng)補償方法，通過對比實驗及誤差分析，驗證了其應(yīng)用可行性，得到如下結(jié)論：

(1)進(jìn)行LED光源漂移特性實驗，建立光源自適應(yīng)補償模型，驗證了光源的漂移特性符合以自然常數(shù)e為底的負(fù)指數(shù)函數(shù)，擬合相關(guān)性達(dá)到99.3%以上，并分析了光源時變補償因子具有自適應(yīng)性。

(2)提出并實現(xiàn)了基于微流控芯片熒光檢測的LED光源自適應(yīng)補償方法，并進(jìn)行對比實驗及誤差分析。結(jié)果表明，經(jīng)過光源自適應(yīng)補償后，免疫熒光檢測的分辨率達(dá)到0.01 ng/mL，CV值提高約50%。