孫 杰，劉 淦，李因茵，陸蔭英

肝癌是世界發(fā)病率第六位高的癌癥，肝癌患者病死率在所有癌癥中位居第二，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是發(fā)病數(shù)最高的肝癌亞型，約占80%～90%。目前HCC的治療主要依賴于外科手術(shù)，局部區(qū)域和系統(tǒng)性治療方法[1-2]。在HCC早期階段，主要運(yùn)用外科手術(shù)對(duì)肝臟進(jìn)行切除和移植；在中期階段，主要采用消融療法以及肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)等局部區(qū)域治療，這些方法既能夠與外科手術(shù)相互結(jié)合，也能夠用于不適合手術(shù)的病例；在HCC的晚期階段，對(duì)于不可進(jìn)行肝切除或具有轉(zhuǎn)移性HCC的患者，索拉非尼是惟一的一線系統(tǒng)性靶向藥物。索拉非尼是口服的多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑，于2007年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于HCC的治療[3]。盡管HCC具有很多治療手段，但患者的預(yù)后水平整體較差，僅有10%的HCC患者生存期超過5年。腫瘤復(fù)發(fā)是患者肝切除后5年內(nèi)面臨的一個(gè)巨大問題，而索拉非尼僅能延長(zhǎng)約3個(gè)月的生命，對(duì)晚期HCC的治療作用十分有限[4-5]。因此，綜合與深入的研究HCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，開發(fā)新型有效的治療手段，對(duì)于HCC患者的治療和預(yù)后具有重要意義。

類泛素化修飾neddylation是一種蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，能夠調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。蛋白質(zhì)的neddylation修飾異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。neddylation是由泛素激活酶E1，泛素偶聯(lián)酶E2和泛素連接酶E3所介導(dǎo)的三步酶聯(lián)反應(yīng)組成。首先，神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育性下調(diào)蛋白8（neuronal precursor cellexpressed developmentally down-regulated protein 8, NEDD8）通過其C端的甘氨酸與泛素激活酶NAE的半胱氨酸活性位點(diǎn)形成一個(gè)高能硫酯鍵。其中，泛素激活酶NAE是由泛素樣修飾酶激活酶 3（ubiquitin like modifier activating enzyme 3,UBA3）與淀粉樣前體蛋白結(jié)合蛋白1（amyloid precursor protein-binding protein 1, APPBP1） 組 成的異源二聚體。隨后，經(jīng)過轉(zhuǎn)硫醇活化反應(yīng)，活化的NEDD8被轉(zhuǎn)移至泛素結(jié)合酶UBC12（ubiquitinconjugating enzyme E2M）上。最后，泛素連接酶E3將NED88轉(zhuǎn)移到底物蛋白上完成對(duì)特異蛋白的neddylation 修飾[8]。

MLN4924是近年來發(fā)現(xiàn)的一種neddylation小分子蛋白抑制劑，能夠抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移，在臨床前研究中具有顯著的抗癌功效，目前已經(jīng)進(jìn)入了部分實(shí)體腫瘤和惡性血液病的Ⅰ期臨床試驗(yàn)[9-13]。MLN4924能夠通過與泛素激活酶NAE的結(jié)合產(chǎn)生共價(jià)化合物，從而抑制其活性，導(dǎo)致底物積累，進(jìn)而引發(fā)DNA損傷反應(yīng)，細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞凋亡，以及細(xì)胞的自噬和衰老，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10，14]。但neddylation在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用，以及MLN4924在治療HCC中的功效目前并不完全清楚。因此，本課題組對(duì)MLN4924在具有索拉非尼耐藥性HCC細(xì)胞中的抗癌效果和機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2和Huh-7細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫?？筃EDD8，APPBP1和Actin抗體購(gòu)自Abcam公司。抗UBA3抗體購(gòu)自GeneTex。抗UBC12抗體購(gòu)自于Cell signaling。CCK試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。索拉非尼和MLN4924抑制劑購(gòu)自Selleckchem公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) HepG2和Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃，5 %CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2 CCK檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HepG2或Huh-7 細(xì)胞，以每孔 2000個(gè)細(xì)胞接種于 96孔板，每孔加150 μl培養(yǎng)基，細(xì)胞接種24 h后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度梯度（0/0.25/0.50/1.00 μM）加入抑制劑MLN4924，培養(yǎng)后每孔加入 CCK-8 溶液 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 1～2 h；在酶標(biāo)儀上測(cè)量各孔吸光度值，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm，記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 將HepG2和Huh-7細(xì)胞裂解后進(jìn)行蛋白 SDS-PAGE，將膠浸泡于電轉(zhuǎn)液中（Tris 25 mM，甘氨酸 190 mM，20% 甲醇），電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加入10%牛奶封閉1 h，加入封閉液稀釋（抗體稀釋倍數(shù)為1∶1000）的一抗后4 ℃過夜。用TBST（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1% 吐溫 20） 洗滌 3 次，加入封閉液稀釋的二抗，37 ℃孵育1 h，洗滌3次，最后用ECL顯色。

1.2.4 索拉非尼耐藥細(xì)胞的建立 在HepG2 和Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)基中添加終濃度為0.25 μM的索拉非尼，初期每周更換1次培養(yǎng)基，中后期根據(jù)細(xì)胞匯合濃度提高換液頻率。在建立初期，以48 h作為細(xì)胞傳代周期；篩選4周后，培養(yǎng)皿中僅存活少量耐藥細(xì)胞，將存活的耐藥細(xì)胞消化并轉(zhuǎn)移至規(guī)格適宜的培養(yǎng)皿中，以避免細(xì)胞密度過低影響生長(zhǎng)狀態(tài)；繼續(xù)保持索拉非尼藥物壓力進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)，并在細(xì)胞匯合度到達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。經(jīng)過6～7個(gè)月的培養(yǎng)，獲得具有在終濃度為0.25 μM的索拉非尼壓力下生存、傳代能力的耐藥細(xì)胞，我們?cè)谖闹蟹Q之為HepG2-Sora和Huh-7-Sora[15]。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥HCC細(xì)胞的NEDD8修飾通路高度活化 用索拉非尼刺激HepG2和Huh-7 HCC細(xì)胞，檢測(cè)野生型細(xì)胞與索拉非尼耐藥細(xì)胞中NEDD8的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，與野生型HepG2和Huh-7細(xì)胞相比，索拉非尼耐藥的HepG2-Sora和Huh-7-Sora細(xì)胞中NEDD8的蛋白表達(dá)量明顯升高（圖1A）。同時(shí)我們檢測(cè)了與neddylation修飾相關(guān)的多個(gè)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示APPBP1、UBA3 和UBC12的表達(dá)在耐藥細(xì)胞株中都有明顯上調(diào)（圖1B）。以上結(jié)果提示，與野生型細(xì)胞相比，索拉非尼耐藥HCC細(xì)胞中NEDD8修飾通路活化。

2.2 MLN4924抑制細(xì)胞增殖的劑量依賴性 為了檢測(cè)neddylation通路活化對(duì)索拉非尼耐藥細(xì)胞增殖的影響。我們用不同濃度的索拉非尼（0～4 μM）處理HepG2和Huh-7野生型與耐藥型細(xì)胞株，然后再用不同濃度的NEDD8活化激酶抑制劑MLN4924處理細(xì)胞。通過檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，我們發(fā)現(xiàn)在索拉非尼處理細(xì)胞之后，再加入不同濃度的MLN4924 能夠進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖，并且抑制作用隨著MLN4924抑制劑濃度的增加而增強(qiáng)（圖2）。提示MLN4924能夠抑制索拉非尼耐藥細(xì)胞的增殖。

2.3 MLN4924抑制細(xì)胞增殖的時(shí)間依賴性 分別檢測(cè)用2 μM索拉非尼處理后的耐藥細(xì)胞HepG2-Sora和Huh-7-Sora，再經(jīng)MLN4924處理24 h、48 h、72 h和96 h后細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，Huh-7-Sora受MLN4924處理后細(xì)胞增殖明顯減弱，且隨著時(shí)間增加抑制效果增強(qiáng)（圖3）。HepG2-Sora在MLN4924處理后24 h，細(xì)胞增殖就明顯減弱，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用變化不明顯（圖3）。

圖1 耐藥HCC細(xì)胞的NEDD8修飾上調(diào)Short Exp.索拉非尼短期刺激（8 h）；Long Exp.索拉非尼長(zhǎng)期刺激（48 h）；HepG2-WT.野生型HepG2；HohT-WT.野生型HohT-7Figure 1 NEDD8 modification is upregulated in sorafinib-resistant HCC cells

圖2 MLN4924抑制索拉非尼耐藥細(xì)胞的增殖Figure 2 MLN4924 inhibits the proliferation of sorafinib-resistant cells

圖3 MLN4924抑制細(xì)胞增殖的時(shí)間依賴性Figure 3 Time-dependent manner of MLN4924 inhibiting cell proliferation

2.4 MLN4924抑制耐藥HCC細(xì)胞的neddylation修飾 考慮到MLN4924對(duì)索拉非尼耐藥細(xì)胞增殖的抑制作用，我們接下來檢測(cè)了經(jīng)MLN4924處理后索拉非尼耐藥細(xì)胞中neddylation修飾的變化情況。通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MLN4924處理后的索拉非尼耐藥細(xì)胞中NEDD8的表達(dá)量顯著減少，并且隨著MLN4924濃度的增強(qiáng)NEDD8表達(dá)減弱的更加明顯（圖4）。綜上，MLN4924能夠抑制索拉非尼引起的neddylation通路的活化，進(jìn)而抑制HCC細(xì)胞的增殖。

圖4 MLN4924抑制索拉菲尼耐藥HCC細(xì)胞的neddylation修飾Short Exp.索拉非尼短期刺激（8 h）；Long Exp.索拉非尼長(zhǎng)期刺激（48 h）Figure 4 MLN4924 inhibits neddylation modification in sorafinib-resistant HCC cells

3 討 論

全球每年HCC新發(fā)病例數(shù)約80萬人，死亡人數(shù)約78萬，我國(guó)HCC統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)約占全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的55%[16]。索拉非尼作為惟一的一線靶向治療藥物，主要通過兩種方式發(fā)揮作用：一方面能夠抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體和血小板源性生長(zhǎng)因子受體，阻礙腫瘤新生血管的生成，減少腫瘤生長(zhǎng)所依賴的氧氣、能量的供給；另一方面，能夠阻斷腫瘤細(xì)胞中重要信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[17]。然而，索拉非尼對(duì)晚期HCC的治療作用十分有限，其在HCC中的反應(yīng)率還有待提高[18]。主要原因在于HCC具有高度異質(zhì)性，HCC的發(fā)生、發(fā)展與多個(gè)信號(hào)通路的激活相關(guān)，對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)單一信號(hào)通路的調(diào)控不足以達(dá)到良好的治療效果；因此，開發(fā)新型有效的治療手段刻不容緩。

細(xì)胞內(nèi)neddylation的失調(diào)可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，MLN4924作為一種neddylation小分子蛋白抑制劑，其在癌癥治療中的作用受到廣泛關(guān)注。有研究報(bào)道，MLN4924能夠抑制HepG2和Huh-7細(xì)胞系中mTOR信號(hào)通路的活性，誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的自噬和凋亡[19]；并且在人HCC異種移植小鼠模型中，MLN4924表現(xiàn)出了顯著的抗癌效果[19]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼耐藥HCC細(xì)胞HepG2-Sora和Huh-7-Sora的NEDD8修飾通路高度活化，MLN4924能夠通過抑制耐藥細(xì)胞株的neddylation，從而抑制其細(xì)胞增殖。MLN4924對(duì)索拉非尼耐藥細(xì)胞株HepG2-Sora的生長(zhǎng)抑制效果具有劑量和時(shí)間依賴性；而對(duì)Huh-7-Sora的抑制效果僅具有劑量依賴性，沒有顯著的時(shí)間依賴性。MLN4924的單獨(dú)用藥，以及與索拉非尼的聯(lián)合用藥均為HCC治療提供新思路。

其他種類癌癥的相關(guān)研究表明，MLN4924能夠阻礙胃癌與腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，這主要是通過抑制細(xì)胞中Clluin1的neddylation，使Cullin-RING連接酶失活，引發(fā)下游多種底物的積累，造成DNA損傷以及細(xì)胞周期阻滯[20-21]；MLN4924也能夠抑制人食管鱗狀細(xì)胞癌，MLN4924處理導(dǎo)致G2細(xì)胞周期阻滯，并增強(qiáng)Wee1樣蛋白激酶，周期素依賴性激酶抑制劑1A/B和p27的蛋白穩(wěn)定性[22]；在針對(duì)復(fù)發(fā)性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，MLN4924表現(xiàn)出了預(yù)期的藥效和安全性[23]。

綜上，MLN4924通過抑制細(xì)胞內(nèi)neddylation的修飾，減少了索拉非尼耐受HCC細(xì)胞系的生長(zhǎng)增殖。我們的研究為HCC細(xì)胞的耐藥性及MLN4924的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)，為未來HCC治療手段和策略的開發(fā)提供了新的思路。