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        MLN4924對(duì)索拉非尼耐藥肝細(xì)胞癌細(xì)胞中neddylation修飾的抑制作用

        2019-07-17 06:23:08李因茵陸蔭英
        傳染病信息 2019年3期
        關(guān)鍵詞:索拉非尼依賴性泛素

        孫 杰,劉 淦,李因茵,陸蔭英

        肝癌是世界發(fā)病率第六位高的癌癥,肝癌患者病死率在所有癌癥中位居第二,肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是發(fā)病數(shù)最高的肝癌亞型,約占80%~90%。目前HCC的治療主要依賴于外科手術(shù),局部區(qū)域和系統(tǒng)性治療方法[1-2]。在HCC早期階段,主要運(yùn)用外科手術(shù)對(duì)肝臟進(jìn)行切除和移植;在中期階段,主要采用消融療法以及肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)等局部區(qū)域治療,這些方法既能夠與外科手術(shù)相互結(jié)合,也能夠用于不適合手術(shù)的病例;在HCC的晚期階段,對(duì)于不可進(jìn)行肝切除或具有轉(zhuǎn)移性HCC的患者,索拉非尼是惟一的一線系統(tǒng)性靶向藥物。索拉非尼是口服的多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑,于2007年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于HCC的治療[3]。盡管HCC具有很多治療手段,但患者的預(yù)后水平整體較差,僅有10%的HCC患者生存期超過5年。腫瘤復(fù)發(fā)是患者肝切除后5年內(nèi)面臨的一個(gè)巨大問題,而索拉非尼僅能延長(zhǎng)約3個(gè)月的生命,對(duì)晚期HCC的治療作用十分有限[4-5]。因此,綜合與深入的研究HCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,開發(fā)新型有效的治療手段,對(duì)于HCC患者的治療和預(yù)后具有重要意義。

        類泛素化修飾neddylation是一種蛋白質(zhì)的翻譯后修飾,能夠調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。蛋白質(zhì)的neddylation修飾異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。neddylation是由泛素激活酶E1,泛素偶聯(lián)酶E2和泛素連接酶E3所介導(dǎo)的三步酶聯(lián)反應(yīng)組成。首先,神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育性下調(diào)蛋白8(neuronal precursor cellexpressed developmentally down-regulated protein 8, NEDD8)通過其C端的甘氨酸與泛素激活酶NAE的半胱氨酸活性位點(diǎn)形成一個(gè)高能硫酯鍵。其中,泛素激活酶NAE是由泛素樣修飾酶激活酶 3(ubiquitin like modifier activating enzyme 3,UBA3)與淀粉樣前體蛋白結(jié)合蛋白1(amyloid precursor protein-binding protein 1, APPBP1) 組 成的異源二聚體。隨后,經(jīng)過轉(zhuǎn)硫醇活化反應(yīng),活化的NEDD8被轉(zhuǎn)移至泛素結(jié)合酶UBC12(ubiquitinconjugating enzyme E2M)上。最后,泛素連接酶E3將NED88轉(zhuǎn)移到底物蛋白上完成對(duì)特異蛋白的neddylation 修飾[8]。

        MLN4924是近年來發(fā)現(xiàn)的一種neddylation小分子蛋白抑制劑,能夠抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移,在臨床前研究中具有顯著的抗癌功效,目前已經(jīng)進(jìn)入了部分實(shí)體腫瘤和惡性血液病的Ⅰ期臨床試驗(yàn)[9-13]。MLN4924能夠通過與泛素激活酶NAE的結(jié)合產(chǎn)生共價(jià)化合物,從而抑制其活性,導(dǎo)致底物積累,進(jìn)而引發(fā)DNA損傷反應(yīng),細(xì)胞周期停滯,細(xì)胞凋亡,以及細(xì)胞的自噬和衰老,抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10,14]。但neddylation在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用,以及MLN4924在治療HCC中的功效目前并不完全清楚。因此,本課題組對(duì)MLN4924在具有索拉非尼耐藥性HCC細(xì)胞中的抗癌效果和機(jī)制進(jìn)行研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料 HepG2和Huh-7細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫??筃EDD8,APPBP1和Actin抗體購(gòu)自Abcam公司。抗UBA3抗體購(gòu)自GeneTex。抗UBC12抗體購(gòu)自于Cell signaling。CCK試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。索拉非尼和MLN4924抑制劑購(gòu)自Selleckchem公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) HepG2和Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃,5 %CO2培養(yǎng)箱中。

        1.2.2 CCK檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HepG2或Huh-7 細(xì)胞,以每孔 2000個(gè)細(xì)胞接種于 96孔板,每孔加150 μl培養(yǎng)基,細(xì)胞接種24 h后,按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度梯度(0/0.25/0.50/1.00 μM)加入抑制劑MLN4924,培養(yǎng)后每孔加入 CCK-8 溶液 10 μl,繼續(xù)培養(yǎng) 1~2 h;在酶標(biāo)儀上測(cè)量各孔吸光度值,測(cè)定波長(zhǎng)450 nm,記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞增殖曲線。

        1.2.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 將HepG2和Huh-7細(xì)胞裂解后進(jìn)行蛋白 SDS-PAGE,將膠浸泡于電轉(zhuǎn)液中(Tris 25 mM,甘氨酸 190 mM,20% 甲醇),電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,加入10%牛奶封閉1 h,加入封閉液稀釋(抗體稀釋倍數(shù)為1∶1000)的一抗后4 ℃過夜。用TBST(50 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,1% 吐溫 20) 洗滌 3 次,加入封閉液稀釋的二抗,37 ℃孵育1 h,洗滌3次,最后用ECL顯色。

        1.2.4 索拉非尼耐藥細(xì)胞的建立 在HepG2 和Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)基中添加終濃度為0.25 μM的索拉非尼,初期每周更換1次培養(yǎng)基,中后期根據(jù)細(xì)胞匯合濃度提高換液頻率。在建立初期,以48 h作為細(xì)胞傳代周期;篩選4周后,培養(yǎng)皿中僅存活少量耐藥細(xì)胞,將存活的耐藥細(xì)胞消化并轉(zhuǎn)移至規(guī)格適宜的培養(yǎng)皿中,以避免細(xì)胞密度過低影響生長(zhǎng)狀態(tài);繼續(xù)保持索拉非尼藥物壓力進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng),并在細(xì)胞匯合度到達(dá)70%~80%時(shí)進(jìn)行傳代。經(jīng)過6~7個(gè)月的培養(yǎng),獲得具有在終濃度為0.25 μM的索拉非尼壓力下生存、傳代能力的耐藥細(xì)胞,我們?cè)谖闹蟹Q之為HepG2-Sora和Huh-7-Sora[15]。

        2 結(jié) 果

        2.1 耐藥HCC細(xì)胞的NEDD8修飾通路高度活化 用索拉非尼刺激HepG2和Huh-7 HCC細(xì)胞,檢測(cè)野生型細(xì)胞與索拉非尼耐藥細(xì)胞中NEDD8的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示,與野生型HepG2和Huh-7細(xì)胞相比,索拉非尼耐藥的HepG2-Sora和Huh-7-Sora細(xì)胞中NEDD8的蛋白表達(dá)量明顯升高(圖1A)。同時(shí)我們檢測(cè)了與neddylation修飾相關(guān)的多個(gè)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示APPBP1、UBA3 和UBC12的表達(dá)在耐藥細(xì)胞株中都有明顯上調(diào)(圖1B)。以上結(jié)果提示,與野生型細(xì)胞相比,索拉非尼耐藥HCC細(xì)胞中NEDD8修飾通路活化。

        2.2 MLN4924抑制細(xì)胞增殖的劑量依賴性 為了檢測(cè)neddylation通路活化對(duì)索拉非尼耐藥細(xì)胞增殖的影響。我們用不同濃度的索拉非尼(0~4 μM)處理HepG2和Huh-7野生型與耐藥型細(xì)胞株,然后再用不同濃度的NEDD8活化激酶抑制劑MLN4924處理細(xì)胞。通過檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,我們發(fā)現(xiàn)在索拉非尼處理細(xì)胞之后,再加入不同濃度的MLN4924 能夠進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖,并且抑制作用隨著MLN4924抑制劑濃度的增加而增強(qiáng)(圖2)。提示MLN4924能夠抑制索拉非尼耐藥細(xì)胞的增殖。

        2.3 MLN4924抑制細(xì)胞增殖的時(shí)間依賴性 分別檢測(cè)用2 μM索拉非尼處理后的耐藥細(xì)胞HepG2-Sora和Huh-7-Sora,再經(jīng)MLN4924處理24 h、48 h、72 h和96 h后細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示,Huh-7-Sora受MLN4924處理后細(xì)胞增殖明顯減弱,且隨著時(shí)間增加抑制效果增強(qiáng)(圖3)。HepG2-Sora在MLN4924處理后24 h,細(xì)胞增殖就明顯減弱,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用變化不明顯(圖3)。

        圖1 耐藥HCC細(xì)胞的NEDD8修飾上調(diào)Short Exp.索拉非尼短期刺激(8 h);Long Exp.索拉非尼長(zhǎng)期刺激(48 h);HepG2-WT.野生型HepG2;HohT-WT.野生型HohT-7Figure 1 NEDD8 modification is upregulated in sorafinib-resistant HCC cells

        圖2 MLN4924抑制索拉非尼耐藥細(xì)胞的增殖Figure 2 MLN4924 inhibits the proliferation of sorafinib-resistant cells

        圖3 MLN4924抑制細(xì)胞增殖的時(shí)間依賴性Figure 3 Time-dependent manner of MLN4924 inhibiting cell proliferation

        2.4 MLN4924抑制耐藥HCC細(xì)胞的neddylation修飾 考慮到MLN4924對(duì)索拉非尼耐藥細(xì)胞增殖的抑制作用,我們接下來檢測(cè)了經(jīng)MLN4924處理后索拉非尼耐藥細(xì)胞中neddylation修飾的變化情況。通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)MLN4924處理后的索拉非尼耐藥細(xì)胞中NEDD8的表達(dá)量顯著減少,并且隨著MLN4924濃度的增強(qiáng)NEDD8表達(dá)減弱的更加明顯(圖4)。綜上,MLN4924能夠抑制索拉非尼引起的neddylation通路的活化,進(jìn)而抑制HCC細(xì)胞的增殖。

        圖4 MLN4924抑制索拉菲尼耐藥HCC細(xì)胞的neddylation修飾Short Exp.索拉非尼短期刺激(8 h);Long Exp.索拉非尼長(zhǎng)期刺激(48 h)Figure 4 MLN4924 inhibits neddylation modification in sorafinib-resistant HCC cells

        3 討 論

        全球每年HCC新發(fā)病例數(shù)約80萬人,死亡人數(shù)約78萬,我國(guó)HCC統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)約占全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的55%[16]。索拉非尼作為惟一的一線靶向治療藥物,主要通過兩種方式發(fā)揮作用:一方面能夠抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體和血小板源性生長(zhǎng)因子受體,阻礙腫瘤新生血管的生成,減少腫瘤生長(zhǎng)所依賴的氧氣、能量的供給;另一方面,能夠阻斷腫瘤細(xì)胞中重要信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制腫瘤細(xì)胞增殖[17]。然而,索拉非尼對(duì)晚期HCC的治療作用十分有限,其在HCC中的反應(yīng)率還有待提高[18]。主要原因在于HCC具有高度異質(zhì)性,HCC的發(fā)生、發(fā)展與多個(gè)信號(hào)通路的激活相關(guān),對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)單一信號(hào)通路的調(diào)控不足以達(dá)到良好的治療效果;因此,開發(fā)新型有效的治療手段刻不容緩。

        細(xì)胞內(nèi)neddylation的失調(diào)可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生,MLN4924作為一種neddylation小分子蛋白抑制劑,其在癌癥治療中的作用受到廣泛關(guān)注。有研究報(bào)道,MLN4924能夠抑制HepG2和Huh-7細(xì)胞系中mTOR信號(hào)通路的活性,誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的自噬和凋亡[19];并且在人HCC異種移植小鼠模型中,MLN4924表現(xiàn)出了顯著的抗癌效果[19]。我們的研究發(fā)現(xiàn),索拉非尼耐藥HCC細(xì)胞HepG2-Sora和Huh-7-Sora的NEDD8修飾通路高度活化,MLN4924能夠通過抑制耐藥細(xì)胞株的neddylation,從而抑制其細(xì)胞增殖。MLN4924對(duì)索拉非尼耐藥細(xì)胞株HepG2-Sora的生長(zhǎng)抑制效果具有劑量和時(shí)間依賴性;而對(duì)Huh-7-Sora的抑制效果僅具有劑量依賴性,沒有顯著的時(shí)間依賴性。MLN4924的單獨(dú)用藥,以及與索拉非尼的聯(lián)合用藥均為HCC治療提供新思路。

        其他種類癌癥的相關(guān)研究表明,MLN4924能夠阻礙胃癌與腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移,這主要是通過抑制細(xì)胞中Clluin1的neddylation,使Cullin-RING連接酶失活,引發(fā)下游多種底物的積累,造成DNA損傷以及細(xì)胞周期阻滯[20-21];MLN4924也能夠抑制人食管鱗狀細(xì)胞癌,MLN4924處理導(dǎo)致G2細(xì)胞周期阻滯,并增強(qiáng)Wee1樣蛋白激酶,周期素依賴性激酶抑制劑1A/B和p27的蛋白穩(wěn)定性[22];在針對(duì)復(fù)發(fā)性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中,MLN4924表現(xiàn)出了預(yù)期的藥效和安全性[23]。

        綜上,MLN4924通過抑制細(xì)胞內(nèi)neddylation的修飾,減少了索拉非尼耐受HCC細(xì)胞系的生長(zhǎng)增殖。我們的研究為HCC細(xì)胞的耐藥性及MLN4924的作用機(jī)制提供了理論依據(jù),為未來HCC治療手段和策略的開發(fā)提供了新的思路。

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