趙天霞 沈 飛 周曰春 劉 瀟 方 勇 李 彭 裴 斐 邢常瑞

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心1，南京 210023)(南京靈山糧食儲(chǔ)備庫(kù)有限公司2, 南京 211599)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)的主要糧食品種之一，但也是最易被霉菌污染的食品原料之一。小麥中富含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是微生物生長(zhǎng)的良好培養(yǎng)基，當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，微生物就會(huì)繁殖，造成小麥霉?fàn)€變質(zhì)[1]。霉菌滋生不僅消耗谷物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使谷物品質(zhì)降低，還會(huì)產(chǎn)生真菌毒素，對(duì)人畜健康造成了嚴(yán)重威脅[2]。因此，小麥霉變狀況的檢測(cè)分析具有重要意義[3]。從目前來(lái)看，常用的小麥霉變檢測(cè)方法包括平板計(jì)數(shù)法[4]、酶聯(lián)免疫法[5]、熒光染色法[6]等，雖然這些方法的檢測(cè)精度普遍較高，但均存在過(guò)程繁瑣、時(shí)效性差等不足，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)的需求，存在很大局限性[7]。因此，急需發(fā)展一種快捷方便的檢測(cè)技術(shù)來(lái)解決小麥霉變的檢測(cè)難題。

近年來(lái)，基于氣敏傳感器陣列和模式識(shí)別的電子鼻技術(shù)已在環(huán)境檢測(cè)[8]、食品[9-10]、化工[11]、醫(yī)藥[12]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。電子鼻由非特定的化學(xué)檢測(cè)器組成，它們與不同的揮發(fā)性分子相互作用并提供電子信號(hào)，可以有效地用作與產(chǎn)品相關(guān)的揮發(fā)性分子的指示，并通過(guò)模式識(shí)別系統(tǒng)識(shí)別和量化氣味，在谷物霉變快速檢測(cè)中具有巨大的應(yīng)用潛力[13]。崔麗靜等[14]采用電子鼻技術(shù)對(duì)40個(gè)正常玉米樣品和41個(gè)霉變樣品建立了識(shí)別模型，并通過(guò)優(yōu)化10個(gè)傳感器組合，提高了樣品的霉變判別率。Eifler等[15]利用電子鼻差異檢測(cè)小麥籽粒中的鐮刀菌，結(jié)果顯示，電子鼻能較好地區(qū)分感染鐮刀菌和未感染的小麥谷粒，且準(zhǔn)確度高于80%。Campagnoli等[16]通過(guò)研究驗(yàn)證了電子鼻可以區(qū)分已被黃曲霉毒素污染的樣品和未被污染的樣品，且電子鼻能夠通過(guò)直接檢測(cè)毒素和基于檢測(cè)與黃曲霉毒素相關(guān)的揮發(fā)性真菌代謝物的間接識(shí)別來(lái)檢測(cè)污染。沈飛[17]等對(duì)谷物中常見(jiàn)霉菌的特征揮發(fā)性氣味物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，線性判別分析(LDA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型對(duì)谷物中黃曲霉類、寄生曲霉類和青霉類樣品的整體判別正確率分別達(dá)到100%和97.4%。

目前，小麥有害霉菌侵染及霉變程度的快速檢測(cè)仍是一大難點(diǎn)。前人利用電子鼻等技術(shù)進(jìn)行霉變小麥定性判別已證明其可行性，但研究仍有待深入，未實(shí)現(xiàn)霉變程度的定性定量同步分析。因此，本研究擬以受不同有害霉菌侵染的小麥籽粒為對(duì)象，獲取不同儲(chǔ)藏階段(0、1、3、5和7 d)小麥揮發(fā)性氣味的電子鼻響應(yīng)信號(hào)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法建立小麥霉菌侵染程度的定性與定量同步分析方法，為利用電子鼻技術(shù)實(shí)現(xiàn)谷物品質(zhì)快速分析提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥樣品(徐麥33，水分含量16.0%)。除雜并篩選籽粒飽滿、無(wú)異味的樣品，經(jīng)Co-60輻照(劑量：12 kGy)滅菌后裝入無(wú)菌塑料密封袋，4 ℃冷藏，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 霉菌培養(yǎng)與接種

5種小麥等谷物中常見(jiàn)有害霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：串珠鐮刀菌(F.moniliforme)83227、層出鐮刀菌(F. proliferatum)195647、雪腐鐮刀菌(F.nivale)3.503、寄生曲霉(A.parasiticus)3.3950和赭曲霉(A.ochraceus)3.3486。

在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基上分別接種5種不同的霉菌菌株，放置于28 ℃和相對(duì)濕度85%的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行活化培養(yǎng)。待霉菌生長(zhǎng)到第15天后產(chǎn)生大量孢子，用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面產(chǎn)生的菌絲，并將孢子懸浮液收集于50 mL錐形瓶中，依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 4789.2—2016平板計(jì)數(shù)法分別統(tǒng)計(jì)5種霉菌孢子懸浮液的濃度，并用去離子水調(diào)至約1×105CFU/mL，4 ℃冷藏，備用。

將小麥樣品分為150份，每份150 g，隨機(jī)分成5組，每組30份樣品。分別接種1 mL孢子懸浮液和4 mL無(wú)菌水于小麥樣品表面，每種懸浮液接種30份，隨后分別放于150個(gè)上方有開(kāi)孔的的滅菌塑料盒(規(guī)格：115 mm×115 mm×65 mm)中。隨后轉(zhuǎn)移至28 ℃、85% RH的人工氣候箱中儲(chǔ)藏7 d。

樣品從接種霉菌起，選取時(shí)間節(jié)點(diǎn)0、1、3、5、7 d，隨機(jī)選取受5 種不同霉菌感染的小麥樣品各6 份，樣品放入密封袋中于4 ℃冷藏備用。在檢測(cè)前將冷藏的樣品取出，在室溫下放置約2 h直至樣品溫度趨于室溫，隨后稱取5 g小麥樣品置于20 mL 頂空瓶中，待頂空瓶中空氣抽出即可進(jìn)行電子鼻檢測(cè)。

1.3 儀器設(shè)備

Fox 3000型電子鼻(法國(guó)Alpha MOS公司)由頂空全自動(dòng)進(jìn)樣器、12 個(gè)金屬氧化物傳感器和AlphaSoft 軟件操作系統(tǒng)組成。檢測(cè)參數(shù)如下：樣品采集時(shí)間60 s，采樣頻率1 次/s，載氣流速150 mL/min，保溫室溫度60 ℃，采樣速度1 mL/s，震蕩速度500 r/min，保溫時(shí)間120 s。樣品進(jìn)行4次重復(fù)測(cè)定，取平均值進(jìn)行分析。測(cè)定時(shí)，采用金屬氧化物傳感器矩陣作為檢測(cè)系統(tǒng)，該傳感器由對(duì)氣體敏感的半導(dǎo)體材料構(gòu)成，當(dāng)揮發(fā)性物質(zhì)接觸到傳感器時(shí)，電阻值會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，記錄下電阻值的變化，并依據(jù)氣味標(biāo)識(shí)和計(jì)量學(xué)軟件對(duì)不同氣味進(jìn)行識(shí)別[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用MATLAB v8.4軟件對(duì)獲取的小麥電子鼻響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行處理和模型建立。為消除噪音及信號(hào)漂移等不良影響，采用標(biāo)準(zhǔn)化(Autoscale)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(standard normal variate，SNV)等方法對(duì)傳感器響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行預(yù)處理。隨后，運(yùn)用主成分分析(principal component analysis，PCA)、線性判別分析(liner discriminant analysis，LDA)對(duì)不同霉變程度的小麥樣品進(jìn)行區(qū)分和判別；運(yùn)用偏最小二乘回歸分析(partial least squares regression，PLSR)對(duì)小麥樣品菌落總數(shù)水平進(jìn)行定量預(yù)測(cè)，其評(píng)估指標(biāo)包括模型決定系數(shù)(correlation coefficient of determination,R2)、建模和預(yù)測(cè)均方根誤差(root mean squared error of calibration and prediction, RMSEC/RMSEP)、交互驗(yàn)證均方根誤差(root mean squared error of cross validation, RMSECV)以及相對(duì)分析偏差(residual predictive deviation, RPD)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品菌落總數(shù)分析

圖1為儲(chǔ)藏期間小麥樣品菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)圖。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，依據(jù)菌落總數(shù)可將小麥樣品分為未霉變[<2.7 log(CFU/g)]、開(kāi)始霉變[2.7～4 log(CFU/g)]和嚴(yán)重霉變[>4 log(CFU/g)]3個(gè)階段。由圖1可知，除層出鐮刀菌組外，其余四組染菌樣品在0～1 d時(shí)菌落總數(shù)均低于2.5 log(CFU/g)，處于未霉變狀態(tài)，原因是在初期，樣品剛感染霉菌，霉菌均覆蓋于樣品表面，未引起樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，因此將0～1 d判為未霉變階段。當(dāng)儲(chǔ)存至3 d時(shí)，所有樣品的菌落數(shù)均在2.7～4 log(CFU/g)間，此時(shí)，霉菌已開(kāi)始進(jìn)入樣品內(nèi)部并引起內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變，將此階段劃分為開(kāi)始霉變階段。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間達(dá)5～7 d，霉菌快速增長(zhǎng)，霉變程度也不斷加深，樣品基本已達(dá)到嚴(yán)重霉變狀態(tài)。其中，層出鐮刀菌組可能由于活性較強(qiáng)，繁殖能力最大，因此菌落總數(shù)最多。從整體變化趨勢(shì)來(lái)看，盡管不同霉菌的繁殖能力有差異，但菌落總數(shù)呈現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)，表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，霉菌在樣品中不斷繁殖，同時(shí)產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致小麥揮發(fā)性成分不斷變化。

圖1 不同儲(chǔ)藏階段小麥菌落總數(shù)變化趨勢(shì)圖

2.2 小麥樣品電子鼻信號(hào)響應(yīng)分析

圖2為受不同霉菌侵染的小麥樣品及受層出鐮刀菌195647侵染的樣品在不同儲(chǔ)藏階段的電子鼻信號(hào)雷達(dá)圖。由圖2a可知，除了傳感器LY2/LG、LY2/gCT以及PA/2響應(yīng)信號(hào)較低外，剩余傳感器對(duì)于小麥產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)更為敏感。從雷達(dá)圖的變化趨勢(shì)和形狀來(lái)看，受不同霉菌侵染的小麥樣品的變化趨勢(shì)大體相似，說(shuō)明不同霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)有相似之處，但也存在一定差異。小麥霉變后會(huì)產(chǎn)生較多的胺類化合物、碳?xì)浠衔镆约胺枷阕寤衔锏?，使得部分傳感器響?yīng)值發(fā)生顯著變化，而烷烴類、硫化氫和氮氧化合物等成分較少，導(dǎo)致其響應(yīng)值變化不大[19]。結(jié)果表明，受不同霉菌侵染的小麥產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)之間存在差異，電子鼻的12 個(gè)傳感器對(duì)不同的氣味的敏感度不同，因此，可應(yīng)用電子鼻對(duì)受不同霉菌侵染的小麥進(jìn)行區(qū)分。

圖2 小麥樣品電子鼻響應(yīng)信號(hào)雷達(dá)圖

由圖2b可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，不同傳感器也呈現(xiàn)出不一致的變化趨勢(shì)。然而，由于揮發(fā)性物質(zhì)的組成十分復(fù)雜，而電子鼻傳感器的非特異性屬性，因此，不同傳感器隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化規(guī)律并不十分顯著。隨著小麥霉變程度的加深，PA/2、T30/1等代表碳水化合物、芳香族化合物、氮化合物類的物質(zhì)響應(yīng)信號(hào)存在減弱趨勢(shì)，而代表醇、酮類物質(zhì)的LY2/G、LY2/AA的響應(yīng)信號(hào)逐漸增強(qiáng)。結(jié)果表明有害霉菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)消耗小麥中的碳水化合物、蛋白質(zhì)和酯類等有機(jī)物，生成醇酮等次級(jí)產(chǎn)物。這些物質(zhì)在霉菌的代謝過(guò)程中產(chǎn)生，使得電子鼻響應(yīng)值發(fā)生不斷變化[20]。

2.3 PCA結(jié)果分析

依據(jù)菌落總數(shù)，將所有樣品劃分為未霉變、開(kāi)始霉變和嚴(yán)重霉變?nèi)?。主成分分析結(jié)果如圖3所示，其中第一主成分的貢獻(xiàn)率為92.07%，第三主成分的貢獻(xiàn)率為1.99%，全部貢獻(xiàn)率達(dá)94.06%，代表了原始變量的大部分信息。由圖可知，不同程度的霉變樣品存在一定的聚類趨勢(shì)。未霉變樣品點(diǎn)分布與霉變樣品分布存在較大差異，原因可能在于小麥在霉變過(guò)程中產(chǎn)生了特殊的揮發(fā)性物質(zhì)，導(dǎo)致其電子鼻的響應(yīng)信號(hào)出現(xiàn)系統(tǒng)差異。然而，由于不同霉菌侵染樣品產(chǎn)生的氣味影響可能互相混淆，開(kāi)始霉變和嚴(yán)重霉變的小麥樣品存在部分重疊，但仍有一定的分離趨勢(shì)，表明隨著霉變程度的加深，樣品內(nèi)部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被快速分解并產(chǎn)生大量揮發(fā)性物質(zhì)，造成其電子鼻信號(hào)發(fā)生相應(yīng)改變。結(jié)果表明，不同霉變程度的小麥樣品的電子鼻信號(hào)存在差異，為進(jìn)一步的判別分析奠定了基礎(chǔ)。

圖3 受不同霉菌侵染的小麥樣品電子鼻主成分分析圖

2.4 LDA結(jié)果分析

利用用LDA法將所有樣品依據(jù)其菌落總數(shù)分為未霉變、開(kāi)始霉變和嚴(yán)重霉變?nèi)?。?為L(zhǎng)DA模型判別結(jié)果。由表1可知，LDA 模型可較好區(qū)分受單一優(yōu)勢(shì)霉菌侵染的樣品，建模集準(zhǔn)確率均為 100%，驗(yàn)證集中僅串珠鐮刀菌83227和層出鐮刀菌3.507組中分別有1個(gè)樣品被誤判，剩余組樣品均能被成功區(qū)分。當(dāng)將受不同霉菌侵染的樣品綜合在一起建立模型時(shí)，其判別正確率有所降低，驗(yàn)證集為84.0%。另外，從假陰性和假陽(yáng)性指標(biāo)可知，未被區(qū)分的樣品基本都是被錯(cuò)判的樣品，即霉變樣品多數(shù)錯(cuò)判為未霉變樣品?？赡茉蛟谟诓煌咕a(chǎn)生的揮發(fā)性成分十分復(fù)雜，可能存在相互干擾；另一方面，處于閾值附近的小麥樣品也容易發(fā)生誤判，導(dǎo)致正確率降低。為進(jìn)一步提高模型精度，可在下一步研究中，延長(zhǎng)儲(chǔ)藏時(shí)間并調(diào)整霉菌濃度與霉菌侵染時(shí)間，補(bǔ)充自然霉變的樣品，以不斷提高模型的實(shí)用性和穩(wěn)健性。

總體可知，雖然LDA模型的判別精度有待進(jìn)一步提升，但不同霉變程度的小麥樣品仍能得到較好的區(qū)分，表明儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，小麥的霉變程度也在增加，樣品中的脂肪、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被快速分解，產(chǎn)生大量的毒素和揮發(fā)性物質(zhì)， 導(dǎo)致電子鼻響應(yīng)信號(hào)與儲(chǔ)藏前期產(chǎn)生了較大的差異，為電子鼻氣體傳感器提供了判別基礎(chǔ)。

表1 受霉菌侵染的樣品不同霉變程度下的LDA模型判別結(jié)果

2.5 PLSR結(jié)果分析

小麥樣品中的菌落總數(shù)的PLSR建模結(jié)果如表2所示。由表可知，對(duì)于感染單一霉菌的樣品，建模集的決定系數(shù)Rc2均在 0.85以上，建模均方根誤差(RMSEC)低于 0.40 log CFU/g。其中雪腐鐮刀菌 3.3950 組的模型結(jié)果最優(yōu)，Rc2值達(dá)到 0.984， RMSEP和RPD 值分別為 0.223 log CFU/g和5.51。驗(yàn)證集中，對(duì)單一霉菌進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，Rp2值都超過(guò)0.80，RMSEP值在0.500 log CFU/g左右。除層出鐮刀菌3.503組外，其余4 組模型的RPD值均在2.50以上，說(shuō)明模型相關(guān)性較好，穩(wěn)健性較高。而層出鐮刀菌3.503組的RPD值也達(dá)到2.21，說(shuō)明該模型具有定量分析潛力。將全部樣品進(jìn)行綜合建模時(shí)，精度略有降低，Rp2值和RMSEP值分別為 0.852和0.504 log CFU/g，RMSEP值偏大，導(dǎo)致RPD值降低，介于2～2.5之間，低于單一霉菌侵染組模型。但結(jié)果顯示所有模型的 RPD 值均高于2.0，有用于定量分析的可能。圖4為小麥菌落總數(shù)與電子鼻響應(yīng)值相關(guān)關(guān)系圖，樣品均分布于中心線兩側(cè)，表明兩者具有較高相關(guān)性。結(jié)果表明，通過(guò)電子鼻技術(shù)在預(yù)測(cè)小麥中的菌落總數(shù)含量，判斷小麥?zhǔn)欠癜l(fā)生霉變方面具有可行性。但由于樣品數(shù)量、電子鼻傳感器性能及數(shù)量等的影響，模型的整體預(yù)測(cè)精度仍有待提升。

表2 受不同霉菌侵染的小麥菌落總數(shù)預(yù)測(cè)模型分析結(jié)果

圖4 小麥樣品中菌落總數(shù)與電子鼻響應(yīng)值相關(guān)關(guān)系

3 結(jié)論

本研究通過(guò)電子鼻對(duì)受不同霉菌侵染的小麥樣品在不同儲(chǔ)藏階段的揮發(fā)性氣體成分的檢測(cè)以及多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，建立了電子鼻響應(yīng)信號(hào)與霉菌侵染程度的定性定量分析模型。PCA結(jié)果顯示，樣品在不同霉變程度下的氣味信息變化存在一定的規(guī)律，不同霉變狀態(tài)的樣品可得到較好區(qū)分；運(yùn)用LDA方法對(duì)受單一霉菌侵染的小麥樣品的判別率均在90%以上，對(duì)全部樣品的判別率超過(guò)80%；運(yùn)用PLSR建立樣品菌落總數(shù)的回歸模型，全部樣品的Rp2值和RMSEP值分別為 0.852和0.504log (CFU/g)，RPD值為2.30，表明建立的模型可用于定量分析且模型精度較高。綜上可知，作為一種快速、便捷的氣味檢測(cè)手段，電子鼻傳感技術(shù)在小麥樣品霉變狀態(tài)的區(qū)分及霉變程度的快速識(shí)別方法具有一定可行性，為糧食霉變?cè)缙跈z測(cè)及質(zhì)量評(píng)估提供了技術(shù)參考。