蘇軼男

結(jié)腸直腸癌（CRC）是世界上第三種最常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1]。據(jù)估計，全世界每年約有130 萬CRC 新發(fā)病例和近70 萬死亡病例[2]，CRC 的發(fā)病率和死亡率隨年齡增長而增加[3]。盡管CRC 診斷和治療方法有所改善，但超過50%的患者在治療后仍會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[4]。肝臟是CRC 轉(zhuǎn)移最常見的靶向器官，肝臟轉(zhuǎn)移被認為是CRC 最致命的進展之一，同時肝轉(zhuǎn)移是最關(guān)鍵的預(yù)后風險因素[5]。原發(fā)性CRC患者術(shù)后5年生存率為69.5%～95.7%，而CRC 肝轉(zhuǎn)移患者的術(shù)后5年生存率降至27%～41%[6]。因此，盡早發(fā)現(xiàn)CRC肝轉(zhuǎn)移對于患者的預(yù)后至關(guān)重要。轉(zhuǎn)移是通過多步驟事件來實現(xiàn)的，并且一些mRNA 和miRNA 被認為與肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，例如金屬蛋白酶1 組織抑制劑（TIMP-1）[7]和miRNA-21[8]。然而，目前CRC中肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制仍然不清楚，生物標志物欠缺。本研究分析了GEO數(shù)據(jù)庫中關(guān)于CRC 肝轉(zhuǎn)移的miRNA 和mRNA 表達譜數(shù)據(jù)，以期能夠找到影響CRC 肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，為CRC的實驗和臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù) 本研究所用的數(shù)據(jù)集均來源于NCBI 的GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[9]。mRNA表達數(shù)據(jù)編號為GSE30687，包括2個原發(fā)性CRC樣本和2個CRC肝轉(zhuǎn)移樣本，檢測平臺為GPL571[HG-U133A_2]Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array。miRNA 表達數(shù)據(jù)編號為GSE44121，包括9 個原發(fā)性CRC 樣本和9 個發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的CRC 樣 本 ，基 于 GPL16231 Nanostring nCounter Human microRNA Expression Platform芯片進行檢測。

1.2 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理 基于R軟件（版本號：3.6）中的affy軟件包（版本號：1.62.0）[10]，首先將mRNA的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成R語言中可識別格式。然后，通過Robust-Multi-Array（RMA）方法[11]進行背景矯正和標準化處理，最終得到標準化后的表達值矩陣，用于后續(xù)的差異表達分析。對于miRNAs數(shù)據(jù)，首先得到它們的表達值矩陣數(shù)據(jù)，再通過preprocess Core 函數(shù)包（版本號：1.46.0）對數(shù)據(jù)進行標準化處理。

1.3 差異表達mRNAs 和miRNAs 的篩選 通過與原發(fā)性CRC標本相比較，利用limma函數(shù)包篩選出肝轉(zhuǎn)移CRC樣品中的差異表達mRNAs 和miRNAs。篩選閾值為P＜0.05 和|log2FC|＞0.5。此外，在樣品中進行了差異表達mRNAs的雙向聚類分析。

1.4 基因功能富集分析 利用DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/）在線工具對差異表達mRNA 進行GO 功能和KEGG通路富集分析，最顯著的GO功能和KEGG通路篩選標準為P＜0.05。

1.5 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 本研究利用TargetScan預(yù)測差異表達miRNA 可能調(diào)控的靶基因，形成miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系對，并且篩選出包含差異表達mRNA 的miRNA-mRNA 關(guān) 系 對[12]，利 用 Cytoscape 軟 件[13]構(gòu) 建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。此外，篩選出“節(jié)點度”≥1 的基因?！肮?jié)點度”是指與該基因相關(guān)聯(lián)的基因數(shù)。

2 結(jié)果

Fig.1 The two-way cluster graph of DEGs and four samples圖1 差異表達mRNA和4個樣本的雙向聚類圖

2.1 差異表達mRNA 和miRNA 在CRC 肝轉(zhuǎn)移樣本中發(fā)生差異表達的mRNAs 共180 個，其中表達下調(diào)的有116個，表達上調(diào)的有64個，其與mRNA表達數(shù)據(jù)中的4 個樣本的雙向聚類圖，見圖1。此外，與原發(fā)性CRC 樣本相比，CRC 肝轉(zhuǎn)移樣本中的差異表達miRNAs共15個，其中6個miRNAs表達上調(diào)，9個miRNAs 表達下調(diào)。前30 個最顯著的差異表達的mRNAs見表1；所有的差異表達miRNAs見表2。

Tab.1 The top 30 most significant differential expression mRNAs in CRC samples with liver metastasis表1 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移樣本中前30個最顯著的差異表達mRNAs

2.2 功能富集分析 差異表達mRNAs富集于32個GO terms，其中包括11 個細胞組分（CC）、13 個生物學過程（BP）和8 個分子功能（MF）。根據(jù)P值由小到大排列篩選出的前10個GO terms，見表3。另外，這些差異表達mRNAs 主要富集在包括類固醇生物合成（steroid biosynthesis）和霍亂弧菌感染（vibrio cholerae infection）在內(nèi)的2條通路中，見表4。

Tab.2 The differential expression miRNAs in CRC samples with liver metastasis表2 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移樣本中差異表達miRNAs

2.3 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 首先獲得了由差異表達 miRNAs 調(diào)節(jié)的 555 個 miRNA-mRNA 關(guān)系對，其中差異表達mRNAs 參與的關(guān)系對為50 個。基于該50 個miRNA-mRNA 關(guān)系對構(gòu)建了miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。具有較高節(jié)點度的前8個基因，包括纖連蛋白1（FN1）和骨髓嗜病毒整合位點1（MEIS1）等，見表5。

Tab.3 The top 10 enriched GO terms of differential expression mRNAs according to the P-value表3 根據(jù)P值篩選的差異表達mRNA富集的前10個GO terms

Tab.4 The enriched KEGG pathway of differential expression mRNAs表4 差異表達基因富集的KEGG通路

Fig.2 The miRNA-mRNA network圖2 miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖

Tab.5 The top 8 genes with higher degree in the miRNA-mRNA network表5 miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖中具有較高節(jié)點度的前8個基因

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與原發(fā)性CRC 標本相比，在具有肝轉(zhuǎn)移的CRC 標本中篩選出了差異表達mRNAs，并且它們主要富集于生物轉(zhuǎn)化和質(zhì)量相關(guān)的GO terms 中（表3），例如陰離子轉(zhuǎn)運和脂肪酸生物合成。此外，前3 個最重要的生物學過程是陰離子轉(zhuǎn)運（anion transport）、維生素A 應(yīng)答（response to vitamin A）和脂肪酸生物合成（fatty acid biosynthetic）。陰離子轉(zhuǎn)運在物質(zhì)代謝和藥物作用中起著關(guān)鍵作用，例如有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白（OAT）主要參與調(diào)控許多小有機陰離子分子通過上皮屏障和體液隔室中的跨細胞運動[14]。人類小管多特異性O(shè)AT 在各種人類癌細胞中表達，包括CRC 細胞和耐藥細胞[15]。OAT2 被認為是預(yù)測尿嘧啶-替加氟加亞葉酸（UFT/LV）治療方案對CRC 患者治療效果的生物標志物[16]。有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽1A2（OATP1A2）和有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白6（OCT6）是三陰性乳腺癌對新輔助化療方法病理反應(yīng)的預(yù)測因子[17]。本研究結(jié)果顯示肝轉(zhuǎn)移的CRC 樣品中篩選出的差異表達mRNA 主要富集于陰離子轉(zhuǎn)運過程，表明陰離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的生物學過程可能與CRC 的肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。部分研究發(fā)現(xiàn)，維生素A 可以促進CRC 細胞凋亡[18]。另有研究認為，脂肪酸攝入是CRC的危險因素[19]，脂肪酸分布影響CRC的預(yù)后效果[20]。本文研究顯示維生素A應(yīng)答和脂肪酸生物合成是差異表達mRNA 主要富集的生物學過程，提示維生素A應(yīng)答和脂肪酸生物合成相關(guān)的生物學過程與CRC 的預(yù)后有關(guān)，并且對它們的探索可能有助于篩選作為CRC診斷和治療的一些生物標志物。

CRC 是一種雌激素依賴性惡性腫瘤，類固醇硫酸酯酶可以控制組織內(nèi)雌激素濃度。部分研究顯示，CRC 中的類固醇硫酸酯酶表達可能會降低[21]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，類固醇生物合成參與CRC 從腺瘤到癌的進展過程[22]。此外，一些性類固醇受體的遺傳變異也可能與CRC流行病學的性別差異有關(guān)[23]。雖然很少有研究探討霍亂弧菌感染與CRC 之間的關(guān)系，但通常認為病毒感染可能會增加患CRC 的風險[24]。 曹 燕 青 等[25]研 究 認 為 ，乙 型 肝 炎 病 毒（hepatitis B virus，HBV）感染降低了左半結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的風險，并提高了肝轉(zhuǎn)移病灶的手術(shù)切除率。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)差異表達mRNA 主要富集于類固醇生物合成和霍亂弧菌感染相關(guān)通路中，表明類固醇生物合成和霍亂弧菌感染可能會影響CRC的肝轉(zhuǎn)移。然而，有必要進一步探討這些通路是如何影響CRC肝轉(zhuǎn)移的。

在構(gòu)建的miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)圖中，F(xiàn)N1和MEIS1是節(jié)點度最高的兩個基因。FN1基因編碼纖維連接蛋白1，該蛋白可促進口腔鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移[26]。FN1的轉(zhuǎn)錄激活也可促進CRC 的惡性行為，包括轉(zhuǎn)移[27]。FN1的表達與結(jié)直腸癌的進展和轉(zhuǎn)移密切有關(guān)[28]。此外，F(xiàn)N1是肝細胞癌轉(zhuǎn)移的潛在靶點[29]。因此，F(xiàn)N1基因可能是 CRC 肝轉(zhuǎn)移的潛在生物標志物。MEIS1是一個同源框基因，其調(diào)節(jié)髓樣白血病的腫瘤發(fā)生和預(yù)后過程[30]。研究表明MEIS1基因在結(jié)直腸癌中表達下調(diào)，其是結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的生物標志物，并且MEIS1可能在CRC 中起到腫瘤抑制劑的作用[31]。此外，在BRAF基因發(fā)生突變的CRC 中MEIS1啟動子發(fā)生顯著的甲基化，其與MEIS1表達降低有關(guān)[31]。本研究結(jié)果顯示，MEIS1是肝轉(zhuǎn)移的CRC 樣品中非常重要的一個差異表達mRNA，表明MEIS1可能參與了CRC的肝轉(zhuǎn)移，盡管很少有研究可以證明這一點。

綜上所述，F(xiàn)N1和MEIS1可能是 CRC 肝轉(zhuǎn)移的潛在生物標志物，但需要進一步的實驗和臨床研究來證明。此外，一些生物過程（例如陰離子轉(zhuǎn)運、維生素A應(yīng)答和脂肪酸生物合成）和通路（例如類固醇生物合成和霍亂弧菌感染）可能與CRC 的肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。