王文莙，曹相玫，馬艷梅，楊媛媛，徐遠義△，黃允寧

胃癌已成為癌癥死亡的第三大病因，其5年生存率低于25%[1-2]。目前，臨床上治療胃癌以外科手術為主，但部分胃癌患者發(fā)現(xiàn)已是晚期，錯失手術機會。因此，尋找低毒、高效的治療胃癌的藥物具有重要意義。研究表明硫酸右旋糖苷（DS）作為低毒藥物能抑制黑色素瘤的轉移[3]。本課題組前期體內外實驗研究表明，DS 能減少胃癌血管生成，減少裸鼠胃癌腹腔種植轉移瘤結節(jié)數(shù)量和體積[4]。但DS 對胃癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制鮮有報道。本研究旨在觀察DS對人胃癌MGC-803細胞增殖和凋亡的影響，從而為研發(fā)胃癌新的治療策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株（MGC-803）購自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液購自美國Hyclone 公司；胎牛血清購自Fumeng Gene公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青霉素/鏈霉素均購自北京Solarbio 公司。DS 購自Sigma公司，將DS溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）用于細胞培養(yǎng)，用22 μm 的過濾器進行無菌過濾，最終使用質量分數(shù)為0.3%?？偟鞍滋崛≡噭┖匈徸設mega 公司；BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、EdU 試劑盒均購自凱基生物公司。AnnexinV-PI 凋亡試劑盒購自貝博公司；Zeste 增強子同源物2（enhancer zeste of homolog 2，EZH2）單克隆抗體（兔抗人）和Cleaved-caspase3 單克隆抗體（兔抗人）均購自Cell Signaling Technology 公司。β-Tublin單克隆抗體（鼠抗人）購自康為世紀公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔多克隆抗體和山羊抗鼠多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。熒光顯微鏡購自Olympus 公司；CO2培養(yǎng)箱購自Formal Scientific 公司；高速低溫離心機購自Thermo Fisher Scientific公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胃癌MGC-803細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d 換液1 次，待細胞接近融合時用0.25%胰酶消化傳代。收集對數(shù)生長期細胞并計數(shù)，傳于60 mm培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁穩(wěn)定后，于對照組及實驗組分別加入等體積PBS和DS（終濃度0.3%）放置于常氧培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2、8、12、24 h收集細胞備檢；24孔板進行爬片，藥物濃度同上。

1.2.2 EdU實驗 收集對數(shù)生長期胃癌MGC-803細胞，將細胞密度調整為8×105個/mL，以400 μL/孔接種于24 孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行細胞爬片。貼壁后實驗組進行DS干預，對照組加入等體積的PBS。干預24 h 后按照EdU 試劑盒說明書進行操作，EdU 溶液孵育2 h 后用4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100 作為促滲劑，Click-It 反應物進行染色，用Hoechst 進行DNA 復染；采用熒光顯微鏡避光采圖。藍色熒光標記細胞總數(shù)，紅色熒光標記增殖的細胞，細胞增殖率=紅色熒光細胞數(shù)/藍色熒光細胞數(shù)×100%。

1.2.3 平板克隆形成實驗 收集對數(shù)生長期胃癌MGC-803細胞，按每個培養(yǎng)皿800 個細胞接種于含培養(yǎng)基的60 mm 皿中，混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，過夜貼壁后實驗組進行DS 干預，對照組加入等量的PBS。干預24 h 后更換為完全培養(yǎng)基，每3～4 d 更換培養(yǎng)基，培育12 d。PBS 沖洗，4%多聚甲醛固定、結晶紫染色、拍照后使用Image-Pro Plus計算每個皿中細胞克隆形成數(shù)目。

1.2.4 流式細胞儀檢測 收集處于對數(shù)生長期的人胃癌MGC-803細胞，制備單細胞懸液，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待過夜貼壁后棄去舊培養(yǎng)基，實驗組加入含0.3%DS的培養(yǎng)基，對照組加入含有等體積PBS的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細胞上清液，用冷的PBS 洗3 遍，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化并收集細胞，其余步驟按照AnnexinV-PI凋亡試劑盒說明書進行操作，于1 h內進行流式細胞儀檢測并分析細胞凋亡情況。

1.2.5 蛋白免疫印跡 將人胃癌MGC-803 細胞接種到60 mm 的培養(yǎng)皿中，過夜貼壁后實驗組加入含有藥物濃度為0.3%DS的培養(yǎng)基，對照組加入含有等量PBS的培養(yǎng)基，收集干預不同的時間點（2、8、12、24 h）的各組細胞，提取細胞蛋白，應用BCA法測定蛋白含量。蛋白免疫印跡（Western blot）中各組上樣60 μg（20 μL）蛋白進行8%SDS-PAGE電泳，80 V（20 min），120 V（40 min）恒壓濕轉PVDF膜，轉膜后用10%脫脂牛奶封閉，兔抗人 EZH2（1∶1 000）、兔抗人 Cleavedcaspase3（1∶1 000）和鼠抗人β-Tublin（1∶2 000）一抗4 ℃孵育過夜，TBST震蕩洗滌3次，以TBST稀釋的HRP標記的山羊抗兔及山羊抗鼠IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 震蕩洗滌3次后ECL化學發(fā)光顯影，曝光采圖，用Photoshop CC 2017軟件進行灰度值分析，用目的條帶灰度值/內參灰度值進行蛋白定量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用IBM SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料均以均數(shù)±標準差（±s）表示，各獨立實驗均重復3次，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DS對MGC-803細胞增殖的抑制作用 EdU實驗結果顯示，實驗組細胞增殖率較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1、表1。

Fig.1 The effect of DS on the proliferation of MGC-803 cells(scale bar=100 μm)圖1 DS對MGC-803細胞增殖的影響（比例尺為100 μm）

2.2 DS對MGC-803細胞集落形成的抑制作用 平板克隆形成實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組新克隆形成數(shù)量明顯減少（P＜0.01），克隆球形成較小且染色較淺，見圖2、表1。

2.3 DS對胃癌MGC-803細胞凋亡的促進作用 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組（P＜0.01），見圖3、表1。

2.4 DS 對 EZH2、Cleaved-caspase3 蛋白表達的影響 Western blot 結果顯示，與對照組相比，實驗組EZH2蛋白水平在2 h無明顯變化，8、12、24 h明顯降低（P＜0.05）；Cleaved-caspase3蛋白水平在2、8、12、24 h較對照組明顯增加（P＜0.05），見圖4、表2。

Tab.1 The effects of DS on proliferation,colony formation and apoptosis of MGC-803 cells表1 DS對MGC-803細胞增殖、克隆形成及凋亡的影響（n=3，±s）

Tab.1 The effects of DS on proliferation,colony formation and apoptosis of MGC-803 cells表1 DS對MGC-803細胞增殖、克隆形成及凋亡的影響（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組實驗組t細胞增殖率（%）76.00±3.61 20.33±4.51 16.700＊＊克隆形成（個/視野）1 189.67±146.74 238.67±35.50 10.910＊＊凋亡率（%）3.5±0.5 14.5±0.5 26.944＊＊

Fig.2 The effect of DS on colony forming ability of MGC-803 cells圖2 DS對MGC-803細胞集落形成能力的影響

Fig.3 The effect of DS on cell apoptosis of MGC-803 cells圖3 DS對MGC-803細胞凋亡的影響

3 討論

胃癌是世界范圍內常見的三大癌癥死亡原因之一[5]，如今，胃癌在亞洲具有較高的發(fā)病率和死亡率[6]，由于大多數(shù)胃癌在明確診斷時已發(fā)展至中晚期，因此，化療成為胃癌治療的方法之一[7]。因傳統(tǒng)的化療藥物易耐藥且不良反應大，因此，尋找低毒、高效、不良反應小的藥物具有重大意義。

Fig.4 The protein expression levels of EZH2 and Cleaved-caspase3 detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測EZH2、cleaved-caspase3蛋白的表達

Tab.2 The protein expression levels of EZH2 and Cleaved-caspase3 detected by Western blot assay表2 Western blot檢測EZH2、Cleaved-caspase3蛋白的表達 （n=3，±s）

Tab.2 The protein expression levels of EZH2 and Cleaved-caspase3 detected by Western blot assay表2 Western blot檢測EZH2、Cleaved-caspase3蛋白的表達 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組實驗組t EZH2蛋白相對表達量2 h 0.82±0.08 0.72±0.17 0.983 8 h 1.05±0.15 0.72±0.10 3.143＊12 h 1.07±0.11 0.52±0.12 5.910＊＊24 h 0.95±0.18 0.35±0.27 3.581＊組別對照組實驗組t Cleaved-caspase3蛋白相對表達量2 h 0.31±0.06 0.58±0.12 3.584＊8 h 0.53±0.05 0.76±0.01 7.271＊12 h 0.38±0.01 0.92±0.01 77.534＊＊24 h 0.46±0.01 0.97±0.02 36.524＊＊

本課題組采用的抗癌藥物DS 屬于大分子硫酸右旋糖苷衍生物，相對分子質量為5×105，具有安全性高、不良反應小、腹腔吸收慢等優(yōu)點[8]。本課題組前期體內外研究表明，DS 有抑制胃癌細胞血管生成，抑制裸鼠胃癌腹腔種植轉移的作用[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)DS 與LOX 抑制劑β-氨基丙腈（BAPN）聯(lián)合應用后抑制胃癌細胞侵襲和轉移的效果較單獨使用DS 或BAPN 更明顯，本研究在前期課題組研究的基礎上選取最佳藥物濃度0.3%DS作為干預劑量[9]，結果表明DS 能明顯抑制MGC-803 細胞的增殖，減弱細胞集落形成能力并誘導MGC-803 細胞凋亡。表觀遺傳在腫瘤的進展當中發(fā)揮重要作用，表觀遺傳學調控失調是惡性腫瘤的一大特點，包括DNA和組蛋白的甲基化[10]。表觀遺傳調控因子EZH2 是PRC2（polycomb repressor complex 2）基因沉默復合物的核心成員，具有甲基轉移酶活性，可催化組蛋白H3K27三甲基化和異染色質形成從而介導抑癌基因表達沉默[11]。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2 在膀胱癌[12]、結直腸癌[13]、卵巢癌[14-15]、肺癌等[16]實體腫瘤中高表達并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后密切相關。EZH2 通過調控增殖相關基因的轉錄，影響腫瘤的生長；在膠質瘤中，下調EZH2 可以抑制膠質瘤細胞的增殖[17-18]，除此之外EZH2 還參與凋亡的相關調控，下調EZH2 可以激活凋亡相關蛋白表達[19]。研究發(fā)現(xiàn)，敲減EZH2可使膠質瘤細胞中caspase3的活性升高，細胞凋亡率明顯增高[20]。Cleaved-caspase3是細胞凋亡相關的蛋白Caspases3的激活體，在細胞凋亡中起著決定性的作用[21]。當?shù)蛲霭l(fā)生時，各個凋亡信號通路最終激活Caspase3從而誘導細胞凋亡。本研究結果表明，DS 可以抑制EZH2，促進Cleavedcaspase3的表達，發(fā)揮促凋亡作用。

綜上所述，DS 可以體外抑制人胃癌MGC-803細胞的增殖并誘導凋亡，其機制可能與抑制EZH2表達有關，為臨床藥物治療胃癌提供了新的思路。但DS如何抑制EZH2的表達發(fā)揮抗腫瘤作用還需進一步研究。