張 娟，魏 霞，李水仙，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101）

舒洛地特有抗血栓、降低血黏度、調(diào)血脂、減少血小板聚集、保護(hù)腎臟等作用，屬多組分生化藥物，有多種生物活性，用于治療有血栓形成危險(xiǎn)的血管性疾病及糖尿病腎病。為保證其用藥安全性，提高藥品質(zhì)量，應(yīng)做好原料藥的安全性檢查，但現(xiàn)行的2015年版《中國(guó)藥典》及局頒標(biāo)準(zhǔn)均未收載舒洛地特。本研究中對(duì)舒洛地特的過敏反應(yīng)、降壓物質(zhì)和異常毒性檢查方法學(xué)進(jìn)行探討，確定限值，為制訂其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 動(dòng)物、儀器與試藥

1.1 動(dòng)物

ICR小鼠75只，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）20140007；Hartley豚鼠42只，普通級(jí)，體質(zhì)量250～350 g，雌雄各半，購(gòu)自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）20140006；貓1只，體質(zhì)量3.5 kg，雄性，購(gòu)自市場(chǎng)。飼養(yǎng)條件：小鼠飼養(yǎng)于屏障級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，豚鼠和貓飼養(yǎng)于普通級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，使用許可證號(hào)均為SYXK（魯）20130012。溫度20～25℃，日溫差≤3℃；相對(duì)濕度40% ～70%；每1 h換氣次數(shù)不少于10次；照明12 h，明暗交替。經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意后開始試驗(yàn)。

1.2 儀器

BL-420E型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技公司，量程為 ±0.5 V ～ ±20 μV）；BSA4202S型電子天平（檢測(cè)精度為0.06 mg），CP225D型電子天平（檢測(cè)精度為0.01 mg），均購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司。

1.3 試藥

舒洛地特（國(guó)內(nèi)某公司。樣品A，批號(hào)為DYHSLDT20150501，含量為 12 LSU／mg，干燥失重 1.6%；樣品B，批號(hào)為 DYH-SLDT20150502含量為12 LSU／mg，干燥失重2.7%；樣品C，批號(hào)為DYH-SLDT20150503，含量為 13 LSU／mg，干燥失重1.0%）；氯化鈉注射液（山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司，批號(hào)為16030202，規(guī)格為每支 10 mL ∶90 mg）；苯巴比妥鈉注射液（廣東邦民制藥有限公司，批號(hào)為130535，規(guī)格為每支100 mg）；戊巴比妥鈉（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào)為05636）；肝素鈉（東營(yíng)天東制藥有限公司，批號(hào)為KH2-1704009，純度為98%）；磷酸組胺（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為150510-201313，規(guī)格為每支20 mg）。

2 方法與結(jié)果

2.1 過敏反應(yīng)檢查

限值確定：取豚鼠24只，隨機(jī)分為6組，每組4只，雌雄各半，取樣品 C，將其分別配成 1 200，600，300 LSU／mL濃度的供試品溶液，分別腹腔注射和靜脈注射，給藥體積均為1mL，連續(xù)觀察7d。按每只豚鼠體質(zhì)量 300g 計(jì)（下同），劑量分別為 4000，2000，1000LSU／kg，相當(dāng)于普通成人（60 kg，下同）1 d最大劑量的400倍、200倍和100倍。結(jié)果，4 000 LSU／kg劑量組豚鼠腹腔注射藥物后出現(xiàn)撓鼻、步態(tài)不穩(wěn)等現(xiàn)象，注射1 d后癥狀消失，其他各組豚鼠均未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，提示豚鼠腹腔注射和靜脈注射舒洛地特的無毒性反應(yīng)劑量均不超過2 000 LSU／kg。根據(jù)致敏和激發(fā)劑量應(yīng)小于豚鼠該途徑的急性毒性反應(yīng)劑量，激發(fā)劑量應(yīng)大于致敏劑量的指導(dǎo)原則[1]402，本品過敏反應(yīng)檢查時(shí)采用臨床擬用濃度300 LSU／mL的供試品溶液進(jìn)行致敏和激發(fā)。即設(shè)定致敏劑量為500 LSU／kg，激發(fā)劑量為1 000 LSU／kg。

供試品檢查：取豚鼠18只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，分別對(duì)3批樣品進(jìn)行過敏反應(yīng)檢查（以300 LSU／mL供試品溶液作為致敏液和激發(fā)液），各組豚鼠分別隔日腹腔注射相應(yīng)致敏液0.5mL，連續(xù)注射3次。第1次腹腔注射后14 d每組取3只豚鼠，分別于小隱靜脈注射相應(yīng)激發(fā)液1 mL；第1次腹腔注射后21 d，每組取剩余3只豚鼠，分別于小隱靜脈注射相應(yīng)激發(fā)液1 mL。觀察給藥后30 min內(nèi)產(chǎn)生的反應(yīng)。依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1147“過敏反應(yīng)檢查法”判斷結(jié)果。結(jié)果，豚鼠均未出現(xiàn)豎毛、發(fā)抖、干嘔、連續(xù)噴嚏（或咳嗽）3聲、紫癜和呼吸困難等現(xiàn)象，也未出現(xiàn)二便失禁、步態(tài)不穩(wěn)或倒地、抽搐、休克、死亡現(xiàn)象[1]159[2]428-429，均為陰性。

2.2 降壓物質(zhì)檢查[3-4]

貓的靈敏度檢查方法：貓麻醉后固定于保溫手術(shù)臺(tái)上，分離氣管并插管使呼吸通暢，分離一側(cè)頸動(dòng)脈，插入充滿抗凝劑（1000U／mL的肝素鈉溶液）的動(dòng)脈插管，插管另一端通過生理壓力傳感器與生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)相連，記錄動(dòng)物血壓。分離一側(cè)股靜脈，插入通過軟管與可調(diào)定量加液器相連的靜脈插管，用于注射藥物、組胺并補(bǔ)充氯化鈉注射液[2]335-336。按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1145“降壓物質(zhì)檢查法”，首先檢查動(dòng)物靈敏度，結(jié)果符合規(guī)定。詳見表 1。

表1 貓靈敏度檢查結(jié)果

限值確定：取樣品C，加氯化鈉注射液溶解稀釋，制成濃度為250 LSU／mL的供試品溶液。按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1145“降壓物質(zhì)檢查法”試驗(yàn)，注射劑量（dT）50 LSU／kg，各次注射速率基本相同。分別記錄給藥前后的血壓值，重復(fù)3次，計(jì)算藥物引起血壓下降的反應(yīng)值。結(jié)果，50 LSU／kg劑量下動(dòng)物血壓輕微下降（分別下降 0.70，0.05，0.66 kPa，平均 0.47 kPa）。根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則9301“注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”[1]401，一般以臨床最大單次用藥劑量的0.2～5.0倍作為降壓反應(yīng)物質(zhì)檢查劑量限值，急重病癥盡量采用高限值。考慮到本品臨床最大單次用藥劑量為每天1支（2 mL∶600 LSU），肌肉注射或靜脈注射，連用15～20 d。臨床最大單次用藥劑量的5倍，即為 5×（1×600／60）LSU／kg=50 LSU／kg，因此選用50 LSU／kg的劑量作為檢查限值。

供試品檢查：分別將3批樣品用氯化鈉注射液稀釋成濃度為250 LSU／mL的供試品溶液，dT為50 LSU／kg，磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)品注射劑量（dS）為 0.1 μg／kg，以 dS，dT，dT，dS4個(gè)劑量為1組依次注射，記錄反應(yīng)值。然后以第 1（dS1）與第 3（dT2）、第 2（dT1）與第 4（dS2）劑量所致反應(yīng)值分別比較，如dT所致反應(yīng)值均不大于ds所致反應(yīng)值的50%，即認(rèn)為供試品的降壓物質(zhì)檢查符合規(guī)定；否則按上述次序繼續(xù)注射1組4個(gè)劑量（分別用dS1′，dT1′，dT2′，dS2′表示），并按相同方法分別比較兩組內(nèi)各對(duì)ds、dT劑量所致反應(yīng)值；如dT所致反應(yīng)值均不大于ds所致反應(yīng)值，即認(rèn)為供試品的降壓物質(zhì)檢查符合規(guī)定[1]158[2]336-337。結(jié)果3批舒洛地特的降壓物質(zhì)檢查均符合規(guī)定。詳見表 2。

表2 舒洛地特降壓物質(zhì)檢查結(jié)果

2.3 異常毒性檢查

半數(shù)致死量（LD50）試驗(yàn)[5-7]：取小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。取樣品適量，加氯化鈉注射液配制成濃度為2431 LSU／mL的供試品溶液，并按等比級(jí)數(shù)0.7 稀釋成1701.7，1191.2，833.8，583.7，408.6LSU／mL的系列濃度，分別尾靜脈注射供試品溶液（樣品批號(hào)為DYH-SLDT20150503）48 620，34 034，23 844，16 676，11 674，8 172 LSU／kg，注射劑量為 20 mL／kg，注射速率為0.1 mL／s。觀察給藥后72 h內(nèi)小鼠死亡情況及出現(xiàn)的反應(yīng)，結(jié)果見表 3。Bliss法計(jì)算 72 h內(nèi)LD50。動(dòng)物死亡數(shù)、LD50和LD50可信限結(jié)果見表 4?；貧w方 程Y（Probit）=-11.105+3.734 4 log（D），LD50=20 534 LSU／kg，LD50（Feiller校正）95% 可信限為15 957 ～ 26 580 LSU／kg。

表3 舒洛地特小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果（n=10）

表4 Bliss法計(jì)算舒洛地特 LD50結(jié)果（n=10）

限值確定：根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則9301“注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”[1]401，如難以計(jì)算出最低致死量，可采用小于LD50可信限下限的1／4（建議采用1／8～1／4）。如LD50與臨床體質(zhì)量劑量之比小于20，可采用LD50可信限下限的1／4或LD1可信限下限的1／3。舒洛地特臨床體質(zhì)量最大劑量為10LSU／kg，其LD50與臨床體質(zhì)量劑量之比為2 053.4倍（大于20）。異常毒性檢查限值可采用小于LD50可信限下限的1／8～1／4，即 1994.6～3989.2LSU／kg。異常毒性限值采用LD50可信限下限的 1／8，即 1994.6LSU／kg（≈2000LSU／kg）。為保證用藥安全，限值可適當(dāng)嚴(yán)格，擬確定舒洛地特異常毒性檢查時(shí)采用80 LSU／mL的供試品溶液，每只小鼠靜脈注射給藥0.5 mL，小鼠體質(zhì)量按20 g計(jì)算，劑量相當(dāng)于2 000 LSU／kg。

供試品檢查：取3批供試品，分別用氯化鈉注射液配制成80 LSU／mL的供試品溶液，根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1141，每批供試品取小鼠5只，每只小鼠尾靜脈注射供試品溶液0.5 mL，4～5 s內(nèi)勻速注射完畢。給藥后48 h內(nèi)，3組小鼠均未見死亡，表明3批舒洛地特均符合規(guī)定[1]153[2]305-306。

3 討論

舒洛地特作為抗血栓藥治療各種心血管疾病，在國(guó)外應(yīng)用已超過20年[8]。其生產(chǎn)工藝過程中有可能污染組胺、類組胺樣降血壓物質(zhì)、異源蛋白、未知過敏反應(yīng)物質(zhì)及毒性雜質(zhì)，且缺乏有效的理化分析方法加以判斷，影響藥物的療效及安全性。

過敏反應(yīng)和急性毒性試驗(yàn)均顯示舒洛地特有一定毒性，豚鼠的毒性癥狀主要表現(xiàn)為撓鼻、步態(tài)不穩(wěn)等現(xiàn)象，小鼠的毒性癥狀主要表現(xiàn)為呼吸急促、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、抽搐等，異常毒性設(shè)定限值時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用LD50可信限下限的1／4進(jìn)行供試品異常毒性檢查時(shí)，仍有小鼠死亡，臨床用藥有可能產(chǎn)生過敏及急性不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。但由于其制劑在臨床使用的濃度遠(yuǎn)低于產(chǎn)生毒性的濃度，設(shè)定的過敏反應(yīng)和異常毒性的限值可保證其臨床用藥安全。目前，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家的醫(yī)藥企業(yè)正逐步取消異常毒性檢查項(xiàng)，但我國(guó)醫(yī)藥企業(yè)的生產(chǎn)工藝水平參差不齊，若原料質(zhì)量及工藝控制出現(xiàn)問題，則均會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)摻入[9-10]，毒性反應(yīng)不能忽視，異常毒性檢查仍有必要設(shè)立，以控制毒性雜質(zhì)含量[11]。建議生產(chǎn)廠家加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量控制和改進(jìn)生產(chǎn)工藝[12]。

通過建立舒洛地特原料藥過敏反應(yīng)、降壓物質(zhì)、異常毒性檢查法，可控制由于原料藥質(zhì)量問題在臨床使用中引起的毒性反應(yīng)、過敏反應(yīng)和降壓反應(yīng)等嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生，藥品安全性檢查法控制藥品質(zhì)量的同時(shí)，還可結(jié)合臨床使用，但應(yīng)注意監(jiān)測(cè)凝血指標(biāo)。舒洛地特服藥后可能會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱反應(yīng)，建議進(jìn)一步對(duì)其熱原進(jìn)行檢查，為臨床用藥的安全性提供保障。