陳 曄 ，劉 丹 ，李靈芝 ，3△，張永亮 ，李建宇 ，金 鑫

（1.武警后勤學(xué)院軍事藥學(xué)教研室，天津 300309； 2.武警北京總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，北京 100000；3.天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300309； 4.武警后勤學(xué)院職業(yè)教育中心，天津 300309）

高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與慢性氧化應(yīng)激的增加密切相關(guān)[1]。內(nèi)皮細(xì)胞為接觸血液的第一層細(xì)胞，需應(yīng)對(duì)各種病理和生理挑戰(zhàn)，如氧張力不足等[2]。缺氧會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧富集，自由基代謝紊亂，使細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，對(duì)抗低氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)于心血管疾病的治療具有重要意義。蕨麻是薔薇科委陵菜屬植物鵝絨委陵菜的干燥膨大塊根，具有耐缺氧、抗應(yīng)激、抗氧化、補(bǔ)血和保護(hù)心肌細(xì)胞等活性[3]。其主要含有黃酮類、萜類、多酚類化合物[4]，其中咖啡酸、丁香酸、短葉蘇木酚等多酚化合物具有抗氧化、抗內(nèi)毒素及保肝等藥理作用[5-8]。本研究中通過建立EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞糖氧剝奪模型，探討蕨麻多酚的抗缺氧損傷作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、儀器與試藥

細(xì)胞株：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（EA.hy926，北京醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所）。

儀器：371型CO2培養(yǎng)箱、3111型混合氣體培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司）；Cytation 5型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；UV-1800型紫外分光光度儀（日本Shimadzu公司）；MJ Research PTC-200型聚合酶鏈反應(yīng)儀（美國(guó)MJ Research公司）；Eppendorf 22331型核酸定量?jī)x（德國(guó)Eppendorf公司）；成像分析系統(tǒng)（Gel Pro 4.5工作站）；IX71型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：蕨麻多酚由天津武警后勤學(xué)院軍事藥學(xué)教研室高原醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制；復(fù)方丹參滴丸（天津天士力制藥有限公司，批號(hào)為20151202，規(guī)格為每丸27mg）；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批 號(hào)分別為 20140320，20140521，20140602，20161204）；內(nèi)皮素 -1（ET-1）試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Trizol Reagen（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（美國(guó) Promega公司）；四氮唑鹽（MTT，美國(guó) Sigma公司）；胎牛血清（美國(guó)MRC公司）；DMEM培養(yǎng)液（北京索萊寶科技有限公司）；D-Hank′s溶液（天津武警后勤學(xué)院軍事藥學(xué)教研室高原醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室配制）。

1.2 方法

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)：將EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80% ～90%時(shí)，消化傳代備用。

分組、給藥及模型建立：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后分組，試驗(yàn)分為正常對(duì)照組（A組，DMEM培養(yǎng)液），模型組（B組，缺氧的DHank′s溶液），復(fù)方丹參滴丸組（C 組，2.4 g／L+ 缺氧的D-Hank′s溶液），蕨麻多酚高、中、低質(zhì)量濃度組（D1組，2.4 g／L；D2組，1.2 g／L；D3組，0.6 g／L；分別加缺氧的D-Hank′s溶液）。A組細(xì)胞置5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其余組細(xì)胞置5%CO2-95%N2的三氣培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)2 h。

HE染色：取出單層細(xì)胞爬片的蓋玻片，行HE染色，用中性樹膠封片，于200倍顯微鏡下觀察拍照。

1.3 觀察指標(biāo)

細(xì)胞活力：采用MTT試驗(yàn)將細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以5×103個(gè)／孔的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。按1.2項(xiàng)下方法操作，避光加20 μL MTT，置5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄上清，每孔加150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，采用紫外分光光度儀測(cè)定吸光度（OD）值并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=（OD用藥組-ODA組）／（ODB組-ODA組）。

LDH、NO及ET-1水平：將細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以8×103個(gè)／孔的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。按1.2項(xiàng)下方法操作，取上清液，1 000 r／min離心5 min，收集上清液，采用分光光度法測(cè)定LDH和NO水平，采用放射免疫法測(cè)定ET-1水平。

SOD及 MDA水平：將細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以 8×103個(gè)／孔的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。按1.2項(xiàng)下方法操作，用胰蛋白酶消化、離心、收集細(xì)胞。加1mL磷酸鹽緩沖液（PBS），超聲破碎細(xì)胞。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，采用分光光度法測(cè)定SOD和MDA水平，并計(jì)算SOD／MDA。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）及ET-1 mRNA表達(dá)水平：將內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按1.2項(xiàng)下方法操作，以D-Hank′s溶液洗滌細(xì)胞，Trizol法提取RNA，鑒定RNA純度和完整性后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以 β-actin引物為內(nèi)參。eNOS上游為5′-GCACA GGAAATGTTCACCTAC-3′，下游為 5′-GTATCCAGGT CCATGCAGAC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為 551 bP；ET-1 上游為5′-TTCTCTCTGCTGTTTGTGG-3′，下游為 5′-CAATGTGCTCGGTT GTG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為 614 bP；β-actin 上游為 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游為 5′-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴(kuò) 增長(zhǎng)度為547 bP。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為 94℃ 45 s，62℃ 45 s，72℃30 s，循環(huán)28次。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，以1.5%瓊脂糖凝膠、PCR 產(chǎn)物 5 μL，加 6×loading buffer 2 μL 混合上樣，50 V電泳60 min。利用圖像分析系統(tǒng)分析各條帶光密度值，以 β-actin表達(dá)量為對(duì)照，計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

A組細(xì)胞間聯(lián)接密切，細(xì)胞間隙較小，胞漿飽滿，呈紅染，細(xì)胞核大，呈藍(lán)染。B組細(xì)胞間隙略增大，胞漿紅染變淺，細(xì)胞核固縮，呈深藍(lán)染。與B組比較，C組及D1組細(xì)胞形態(tài)接近正常細(xì)胞形態(tài)。詳見圖 1。

圖1 內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)（HE，×200）

2.2 細(xì)胞活力、LDH、NO和ET-1水平

與A組比較，B組細(xì)胞活力顯著減弱，LDH活性顯著增強(qiáng)，NO含量顯著減少，ET-1顯著增加（P＜0.01）。與B組比較，C組、D1組、D2組細(xì)胞活力均顯著增強(qiáng)（P＜0.01），C組、D1組、D2組、D3組LDH活性均顯著減弱，NO含量顯著增加，ET-1含量顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），且LDH和NO變化呈量效依賴關(guān)系。詳見表 1。

表1 6組內(nèi)皮細(xì)胞活力與LDH、NO、ET-1水平比較（± s，n=6）

表1 6組內(nèi)皮細(xì)胞活力與LDH、NO、ET-1水平比較（± s，n=6）

注：與A組比較，##P＜0.01；與 B組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。表2和圖2同。

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2.3 SOD和MDA水平

與A組比較，B組SOD活性顯著減弱，MDA含量顯著增加，SOD／MDA顯著下降（P＜0.01）；與B組比較，D1組、D2組、D3組SOD活性顯著增強(qiáng)（P＜0.01或P＜0.05），C 組、D1組、D2組、D3組 MDA 含量顯著減少，SOD／MDA顯著升高（P＜0.01）。詳見表 2。

表2 6組內(nèi)皮細(xì)胞SOD及MDA水平比較（± s，n=6）

表2 6組內(nèi)皮細(xì)胞SOD及MDA水平比較（± s，n=6）

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2.4 eNOS mRNA和ET-1 mRNA表達(dá)水平

與A組比較，B組eNOS mRNA表達(dá)水平顯著降低，ET-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與B組比較，D1組和D2組eNOS mRNA表達(dá)水平均顯著升高，C組、D1組、D2組ET-1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。詳見圖 2。

圖2 6組內(nèi)皮細(xì)胞中eNOSmRNA和ET-1mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

本課題組前期已建立起人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（EA.hy926）糖氧剝奪模型，在缺氧2 h后細(xì)胞活力顯著降低，LDH漏出量顯著增加，細(xì)胞存活率降至28%[9]，說明糖氧剝奪2 h已對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，因此本研究中選定內(nèi)皮細(xì)胞缺氧時(shí)間為2 h。復(fù)方丹參滴丸是廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病的中成藥，通過減少過氧化物生成、增加NO合成、減少ET-1合成來發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用[10-11]，故本研究中選用其為陽性對(duì)照藥物。試驗(yàn)結(jié)果顯示，加入復(fù)方丹參滴丸有效成分后，與B組比較，細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，NO合成顯著增加，ET-1 mRNA表達(dá)水平及釋放量均顯著降低，與許晶蘭等[11]的研究結(jié)果一致。

正常生理?xiàng)l件下機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和抗氧化酶對(duì)自由基的清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。SOD是機(jī)體產(chǎn)生的抗氧化酶之一，能清除機(jī)體在正常生理狀態(tài)下產(chǎn)生的氧自由基。SOD活性與反映機(jī)體的自由基清除能力呈正相關(guān)[12]。臨床還將MDA視為與SOD相互匹配的指標(biāo)。作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，MDA可引起細(xì)胞腫脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂[13]。因此，MDA含量不僅反映自由基引起細(xì)胞受損的程度，同時(shí)也反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的嚴(yán)重程度。SOD／MDA能較客觀地反映機(jī)體清除自由基的速率和自由基引起脂質(zhì)過氧化水平[14]。LDH是一種糖酵解酶，是反映細(xì)胞膜完整性的敏感指標(biāo)。本試驗(yàn)中，內(nèi)皮細(xì)胞糖氧剝奪2 h后，B組細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著減弱，MDA含量顯著增加，SOD／MDA顯著降低，而LDH釋放量顯著增加，表明缺氧2 h已引起內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡，自由基堆積導(dǎo)致的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷已引起細(xì)胞損傷；加入蕨麻多酚后細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著減少，SOD／MDA顯著升高，同時(shí)LDH釋放量顯著減少，表明蕨麻多酚能對(duì)抗缺氧缺糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞氧化還原失衡，減輕自由基堆積誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞過氧化損傷。

作為內(nèi)源性舒張血管的活性物質(zhì)，NO水平改變可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病。eNOS在正常內(nèi)皮細(xì)胞中，eNOS能催化氧化L-精氨酸產(chǎn)生NO，以維持正常的心血管收縮功能，eNOS適當(dāng)表達(dá)可維持血管壁功能，它反映了向周圍組織器官供血的敏感程度和有效程度。缺氧下調(diào)了eNOS mRNA的表達(dá)，減少內(nèi)皮細(xì)胞中NO生成，導(dǎo)致血管收縮和血栓形成[15]。本研究中，B組細(xì)胞中eNOS mRNA表達(dá)水平顯著降低，NO含量顯著減少；蕨麻多酚干預(yù)后，模型細(xì)胞eNOS mRNA表達(dá)水平顯著升高，NO含量顯著增加，表明蕨麻多酚能上調(diào)缺氧狀態(tài)下eNOS mRNA的表達(dá)水平，促進(jìn)NO的合成與釋放，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。ET-1是長(zhǎng)效強(qiáng)血管收縮物質(zhì)，能調(diào)節(jié)血管收縮和血壓，參與高血壓和其他多種心血管疾病的發(fā)生。缺氧／缺血能激活低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α，進(jìn)而上調(diào)ET-1的表達(dá)，最終導(dǎo)致血管收縮，血液流速降低[16]。本研究中，糖氧剝奪導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，蕨麻多酚干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)ET-1 mRNA表達(dá)顯著降低，表明蕨麻多酚能抑制糖氧剝奪引起的ET-1升高。

綜上所述，蕨麻多酚對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞糖氧剝奪損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激失衡和維持NO與ET-1間的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。