賀雯茜 楊金玉 徐艷嬌 蘭露露 張程亮 劉東

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是全球廣泛流行的慢性疾病，嚴(yán)重危害人類的生命健康，其發(fā)病過程包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化和肝硬化[1]。目前，常用油酸、軟脂酸或其不同比例的混合物誘導(dǎo)體外肝細(xì)胞脂肪變性模型[2, 3]。亦有研究使用高濃度胎牛血清、醫(yī)用脂肪乳或胰島素培養(yǎng)細(xì)胞，以誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油(TG)沉積[4]。但以上干預(yù)方式皆為模擬油脂類飲食過量攝入而引發(fā)的NAFLD。而現(xiàn)實(shí)生活中，隨著高脂飲食危害意識(shí)的普及和高果糖玉米糖漿作為甜味劑在食品工業(yè)中的廣泛使用，人們的飲食模式逐漸由多油多脂轉(zhuǎn)變?yōu)樯儆投嗵?，特別是多果糖。已有研究表明，軟飲料消費(fèi)量的逐年增長與城市人口NAFLD發(fā)病率增加密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，果糖水飼養(yǎng)C57BL/6小鼠8周即出現(xiàn)明顯的肝臟脂質(zhì)沉積,說明生活中NAFLD的發(fā)生不僅是由油脂導(dǎo)致，果糖也是主要誘因之一[6]。而高脂誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性的細(xì)胞模型已不能契合新飲食模式導(dǎo)致的NAFLD研究需要。因此，本研究采用果糖誘導(dǎo)L02人正常肝細(xì)胞系建立新型脂肪變性細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)該模型與傳統(tǒng)游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)的NAFLD細(xì)胞模型對(duì)脂質(zhì)合成的影響,以期為NAFLD體外研究提供新的策略與途徑。

資料與方法

一、細(xì)胞系

人正常肝細(xì)胞系 L02為華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院肝病研究所饋贈(zèng)。

二、主要試劑

果糖(F3510)、油酸(OA，01383)和軟脂酸(PA，P5585)購自美國Sigma公司；Cell Counting Kit-8試劑盒(HY-K0301-500T， MedChem Express)；油紅O干粉(13071275422，科瑞生物)；DMEM高糖培養(yǎng)基(C11995500BT，Gibco)；胎牛血清(S601P-500，Sera Pro)；胰酶(25200-056，Gibco)；兔抗人多克隆抗體：碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP，85570S，CST)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c，abs111730，absin)、乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1，4190S，CST)和硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1，2794S，CST)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(P0012S，碧云天)；ALT測試盒(C009-2)、AST測試盒(C0010-2)和TG測試盒(A110-1)均購自中國南京建成生物工程研究所。

三、溶液配制

果糖溶液配制：取11.53 g果糖溶解于10 mL DMEM高糖培養(yǎng)液，配成6.4 mol/L母液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要稀釋使用。FFA溶液配制： 取38.08 μL OA和0.0308 g PA分別溶于12 mL 10%無脂牛血清白蛋白溶液中，配成10 mmol/L OA母液和10 mmol/L PA母液。按照OA∶PA = 2∶1的比例配成1 mmol/L FFA溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

四、細(xì)胞活性檢測

將L02肝細(xì)胞接種于96 孔板中(每孔1.3×104個(gè)細(xì)胞)，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液換成總體積為200 μL的含果糖完全培養(yǎng)基，其中果糖濃度依次為0、0.5、1、2、4、8、16、32 mmol/L。培養(yǎng)24 h后向每孔加入20 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。

五、轉(zhuǎn)氨酶的檢測

將L02肝細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)(每孔7×104個(gè)細(xì)胞)，細(xì)胞貼壁后換含不同濃度果糖的培養(yǎng)液干預(yù)24 h。收集培養(yǎng)液，400×g離心5 min，取上清，按照檢測試劑盒說明書檢測ALT和AST。

六、細(xì)胞內(nèi)TG含量測定

將L02肝細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(每孔3.8×105個(gè)細(xì)胞)，細(xì)胞貼壁后分別換含不同濃度果糖(0、1、2、4、8、6、32 mmol/L)和FFA(1 mmol/L)的完全培養(yǎng)液干預(yù)24 h。PBS 清洗3次后收集細(xì)胞，加入2% TritonX-100冰上裂解細(xì)胞40 min，12 000×g離心20 min，取上清，按TG試劑盒說明檢測孔樣本TG含量，按BCA 蛋白定量試劑盒說明檢測各孔樣本蛋白含量，計(jì)算每克蛋白所對(duì)應(yīng)的TG含量(mmol/gprot)。

七、細(xì)胞油紅O染色

24孔板中放入細(xì)胞爬片，用明膠37 ℃包被30 min，種入L02肝細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后加入含不同濃度果糖和FFA的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，后用60%異丙醇潤洗，3 g/L油紅O溶液染色15 min，60%異丙醇洗去浮色。蘇木精染色1 min以內(nèi)，雙蒸水沖洗4～5次至染核清晰背景干凈。于顯微鏡下觀察并采集圖像。

八、蛋白質(zhì)印跡

果糖和FFA處理L02肝細(xì)胞24 h后棄去上清，PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次。加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min。收集裂解液于12 000×g，4℃離心10 min，取上清加入5×蛋白上樣緩沖液，95℃下變性10 min。分別取 10 μL 樣本于100 V電壓下行SDS-PAGE電泳約2 h，于200 mA電流下行電轉(zhuǎn)2.5 h。5%牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃搖床孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。條帶使用ECL液顯影，于暗室中曝光，Image J軟件分析吸光度值。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、果糖對(duì)L02肝細(xì)胞活性無顯著影響

隨著培養(yǎng)液中果糖濃度的升高，L02肝細(xì)胞活性無顯著差異(表1)。說明該范圍濃度內(nèi)的果糖(32 mmol/L及以內(nèi))對(duì)L02肝細(xì)胞活性無顯著影響。

表1 果糖對(duì)L02肝細(xì)胞增殖活性的影響(±s, n= 6)

二、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT及AST含量變化

與未加果糖的對(duì)照組相比，果糖濃度在 0.5、1、2、4、8、16、32 mmol/L時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST含量均無顯著性差異(表2)。說明該范圍濃度內(nèi)的果糖(32 mmol/L及以內(nèi))未導(dǎo)致顯著的L02肝細(xì)胞損傷。

表2 不同濃度果糖培養(yǎng)基上清中ALT、 AST含量變化(±s, n= 6)

三、果糖誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞脂肪變性/果糖促進(jìn)L02肝細(xì)胞脂肪沉積

不同果糖濃度(0、1、2、4、8、16、32 mmol/L)和FFA處理24 h后，L02肝細(xì)胞內(nèi)TG含量分別為無具體數(shù)據(jù)。油紅O染色觀察結(jié)果和細(xì)胞內(nèi)TG含量測定結(jié)果一致(圖1)。隨著果糖濃度升高，細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴增多，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)靠近細(xì)胞膜部位。尤其4 mmol/L果糖組，紅色變深，范圍變大。然而FFA組脂滴大量聚集，且連成片狀。說明4 mmol/L果糖即可導(dǎo)致脂肪在細(xì)胞內(nèi)大量累積，但其脂質(zhì)累積效應(yīng)弱于FFA。

圖1果糖和游離脂肪酸對(duì)L02肝細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響(油紅O染色，×200) A.果糖濃度為0 B.果糖濃度為1 mmol/L C.果糖濃度為4 mmol/L D.FFA組

四、果糖誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白表達(dá)量增加

使用濃度梯度的果糖干預(yù)L02肝細(xì)胞后，結(jié)果4 mmol/L果糖時(shí)，在L02細(xì)胞中ChREBP、SREBP-1c和ACC1的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。而果糖濃度達(dá)到8 mmol/L時(shí)，SCD1蛋白才顯著升高(P<0.05)，但當(dāng)果糖濃度升高至32 mmol/L時(shí)，SCD1蛋白表達(dá)又回到正常水平。說明果糖可能通過上調(diào)細(xì)胞中脂質(zhì)合成蛋白表達(dá)從而導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，但當(dāng)果糖濃度超過一定范圍時(shí)，其促脂質(zhì)合成效果可能會(huì)有所減弱(圖2)。

五、果糖和FFA對(duì)L02肝細(xì)胞脂質(zhì)合成蛋白表達(dá)影響

為比較果糖和FFA導(dǎo)致L02細(xì)胞脂質(zhì)沉積不同，選用4 mmol/L果糖處理L02肝細(xì)胞，結(jié)果L02肝細(xì)胞中SCD1蛋白表達(dá)量比無果糖處理組(對(duì)照組)顯著升高(P<0.05)，ACC1蛋白表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組有增加趨勢(圖3)。

SCD1在FFA組蛋白表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組無顯著性差異。而經(jīng)FFA處理后，L02肝細(xì)胞中ACC1蛋白表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組有下降的趨勢。除此之外，果糖相對(duì)于FFA更顯著提高了L02細(xì)胞內(nèi)ACC1的表達(dá)(P<0.05)。這些結(jié)果說明果糖相對(duì)于FFA，對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成源頭的影響更顯著。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖2果糖對(duì)L02肝細(xì)胞中ChREBP、SREBP-1c、ACC1和SCD1蛋白表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與果糖組比較，#P<0.05

圖3果糖和游離脂肪酸對(duì)L02肝細(xì)胞中ACC1和SCD1蛋白表達(dá)的影響

討 論

NAFLD是與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，以肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積為主要特征。常用的飲食干預(yù)誘導(dǎo)NAFLD的動(dòng)物模型造模周期較長，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型成本昂貴。體外細(xì)胞模型能為動(dòng)物模型提供補(bǔ)充，為探討發(fā)病機(jī)制和藥物治療提供有效補(bǔ)充手段。

目前，NAFLD細(xì)胞模型廣泛使用原代肝細(xì)胞和永生化肝細(xì)胞系，通過培養(yǎng)液中添加高濃度營養(yǎng)物質(zhì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，這些物質(zhì)包括飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、葡萄糖、血清和醫(yī)用脂肪乳等。其中人體肝臟樣本數(shù)量有限，原代細(xì)胞培養(yǎng)極其復(fù)雜，同時(shí)礙于倫理問題常限制其使用[7]。嚙齒動(dòng)物的原代肝細(xì)胞能部分模仿人類的疾病狀況，但培養(yǎng)較長時(shí)間時(shí)，細(xì)胞會(huì)丟失其組織特異性功能。永生化肝細(xì)胞系是原代細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)良替代物，其表型穩(wěn)定，培養(yǎng)便捷，更容易標(biāo)準(zhǔn)化[2]。為了更好模擬人體NAFLD疾病狀態(tài)，獲得可重復(fù)性穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇人正常肝細(xì)胞系L02作為NAFLD體外模型的生物材料。

同樣，誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)性變的方法也有很多。將肝細(xì)胞暴露于高脂培養(yǎng)基是最直接且常用的方法。根據(jù)NAFLD的疾病特點(diǎn)添加的多為FFA，依據(jù)不同類型肝細(xì)胞FFA濃度也有所不同[8, 9]。部分研究在建造NAFLD細(xì)胞模型時(shí)未使用含有脂肪酸的高脂培養(yǎng)基，如在培養(yǎng)基中添加高濃度胎牛血清，但此方法費(fèi)用高[10]。Iwasaki等[11]嘗試使用高葡萄糖誘導(dǎo)HuH7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖對(duì)NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄具有促進(jìn)作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。隨著人們生活習(xí)慣變化，果糖成為NAFLD的新誘因。果糖可誘導(dǎo)肥胖、高脂血癥、IR和高血壓等代謝綜合征的表現(xiàn)已在動(dòng)物及人群研究中得到廣泛證實(shí)[12]。而目前果糖誘導(dǎo)的NAFLD細(xì)胞模型有待進(jìn)一步開發(fā)。

本研究采用梯度濃度的果糖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以4 mmol/L 果糖誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞24 h后，即可顯著增加細(xì)胞內(nèi)TG含量。同時(shí)，該濃度果糖對(duì)細(xì)胞活性無顯著性影響，細(xì)胞未出現(xiàn)顯著性損傷。ChREBP、SREBP-1c、ACC1和SCD1是脂質(zhì)合成中的關(guān)鍵蛋白，在NAFLD形成中其發(fā)揮關(guān)鍵性作用。研究發(fā)現(xiàn)，高糖飼喂肝臟特異性ChREBP敲除小鼠肝臟脂質(zhì)沉積相對(duì)于野生型小鼠顯著減少，而肝臟特異性ChREBP敲除不能減少高脂飼誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)累積[13]。SREBP-1c和ChREBP 在激活脂肪生成中發(fā)揮協(xié)同作用[14]。此外，ChREBP通過調(diào)節(jié)SREBP2蛋白穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)肝臟膽固醇生物合成的新作用，這種機(jī)制似乎對(duì)肝細(xì)胞保護(hù)免受果糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡至關(guān)重要[15]。FAS、ACC1和SCD1是轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和ChREBP的下游靶基因，這三個(gè)脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶的上調(diào)會(huì)顯著促進(jìn)肝臟脂質(zhì)從頭合成[16-17]。果糖在4～32 mmol/L時(shí)即可顯著上調(diào)ChREBP、SREBP-1c和ACC1蛋白表達(dá)。果糖濃度達(dá)到8～16 mmol/L時(shí)SCD1蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)。這些結(jié)果說明4 mmol/L 果糖作用于L02細(xì)胞24 h后，即可上調(diào)肝細(xì)胞脂肪合成基因，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性。

果糖誘導(dǎo)模型和經(jīng)典的FFA誘導(dǎo)模型結(jié)果顯示，與FFA處理組相比，盡管果糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積不如其顯著，但果糖可以顯著增加L02細(xì)胞內(nèi)ACC1和SCD1蛋白的表達(dá)，其中對(duì)SCD1蛋白的增加更為顯著。說明果糖可能主要影響脂質(zhì)合成源頭從而導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。果糖通過誘導(dǎo)脂質(zhì)從頭合成而促使TG累積效率較PA和OA作為原料直接促進(jìn)胞內(nèi)TG沉積更低，這也可能是果糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積弱于FFA的原因。

綜上所述，4 mmol/L 果糖作用于L02細(xì)胞24 h后，即可上調(diào)肝細(xì)胞脂肪合成基因，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變，構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型。此方法不僅造模周期短、費(fèi)用低，且方法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，能較好地模擬高果糖飲食誘發(fā)的NAFLD，為高果糖飲食誘導(dǎo)肝臟脂肪變性進(jìn)展的分子機(jī)制研究提供一種有效可行的新工具。