劉 謙，李 熙

(河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心保定分中心，河北 保定071000)

甘草為豆科甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根莖，是常用的中藥材，性甘，味平，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[1-6]。近年來國內(nèi)外學者對甘草屬植物進行了化學成分的研究，發(fā)現(xiàn)其主要有效成分是黃酮類和三萜皂苷成分，還有少量的生物堿、木質(zhì)素和香豆素等[7-10]。《中國藥典》2015 版一部對甘草藥材的性狀、甘草苷及甘草酸含量采用了顯微鑒別、薄層色譜鑒別等檢測，以進行質(zhì)量控制。通過對不同栽培年齡不同產(chǎn)地的甘草進行比較，無論黃酮還是皂苷類成分含量都有較大差異，有些成分含量甚至差異很大。雖然采用HPLC法能對甘草化學成分進行較好的分離，但其主要用于對甘草酸等特定成分進行分析和檢測。由于植物代謝產(chǎn)物種類繁多、結(jié)構(gòu)迥異，傳統(tǒng)的分析手段難以滿足高通量分析的要求，代謝組學技術的出現(xiàn)為這一問題的解決提供了新的方案。代謝組學技術是近十年來發(fā)展較快的新興組學技術，可對生物或細胞內(nèi)所有小分子代謝產(chǎn)物同時進行定性和定量分析，是系統(tǒng)生物學研究的重要手段。與傳統(tǒng)的化學分離模式相比，代謝組學技術可最大程度揭示中藥化學成分間的協(xié)同作用。本實驗采用代謝組學技術和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法對不同產(chǎn)地甘草的化學成分進行了分析，以中藥的整體觀和多成分、多靶點協(xié)同作用的特點為切入點，充分考慮中藥內(nèi)部化學成分的變化，開展綜合質(zhì)量技術評價，為甘草的規(guī)范化種植提供參考依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 儀器和材料

島津LC-20A高效液相色譜儀，包括SIL-20A自動進樣器，LC-20AT二元梯度泵，帶PDA的SPD-M20A型紫外檢測器；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)；流動相所用乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 樣品處理

取甘草粉末(過3號篩)約0.2 g，精密稱定后置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)35 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18不銹鋼柱，4.6 mm×250 mm，5 μm 粒徑。流動相：梯度洗脫。乙腈：0.05%磷酸溶液/(19-81)至(19-81)，0～8 min；(19-81)至(50-50)，8～35 min；(50-50)至(100-0)，35～36 min；(100-0)至(19-81)，36～40 min。柱溫：35 ℃。進樣量：10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：全離子掃描；離子源溫度：120 ℃。

2 檢測結(jié)果

以乙腈、0.05%磷酸溶液為流動相進行線性梯度洗脫可得到較好的高效液相色譜分離效果。在全離子掃描方式下，三萜皂甙、黃酮和香豆素化合物作為甘草中的主要化學成分，其分子中的羥基易形成穩(wěn)定的氧負離子，在負離子電噴霧的環(huán)境下得到的質(zhì)譜圖(圖1)。由圖1可知，不同類型的化合物其離子響應值有很大的不同。

圖1 甘草樣品的全離子掃描

三萜皂甙、黃酮和香豆素化合物作為甘草中的主要化學成分，表現(xiàn)出的光譜和質(zhì)譜特征有很大的區(qū)別。黃酮類化合物從結(jié)構(gòu)上來看，準分子離子[M+ Cl]-、[M-H]-和[M+ 97]-非常明顯，通過對其結(jié)構(gòu)的分析可判斷出，[M+ 97]-是[M+ HSO4]-，這可輔助分子量的確證。在樣品的濃度比較高的條件下，[2M-H]-也有可能形成。這些準分子離子是確定該類化合物結(jié)構(gòu)的重要途徑。香豆素類化合物與黃酮的準分子離子峰產(chǎn)生的途徑比較類似，[M+ Cl]-、[M-H]-和[M+ HSO4]-出現(xiàn)的概率大。而在三萜皂甙類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中含有葡萄糖醛酸，產(chǎn)生的準分子離子也有明顯的結(jié)構(gòu)特征。通過對光譜、質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析并結(jié)合文獻報道，對甘草分離出的80余個主要峰進行分析，大致確定了40個主要成分的可能結(jié)構(gòu)。鑒定出的化合物的名稱、紫外最大吸收、準分子離子峰分析，見表1。

續(xù)表1 甘草中的40種主要化學成分

甘草的質(zhì)量取決于其物質(zhì)基礎，通過對甘肅、新疆、內(nèi)蒙、寧夏四地的甘草樣品進行檢測，對比檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甘肅、寧夏的西北甘草多含甘草酸、甘草甙、異甘草甙、甘草香豆酮、異甘草黃酮醇、甘草異黃酮甲、甘草黃酮醇、甘草豆精-7-甲醚、甘草西定、甘草利酮、甘草寧F、G、H、I、甘草酚等；新疆甘草含甘草酸、甘草甙、異甘草甙、刺芒柄花素、甘草異黃酮B、甘草素、甘草西定等；內(nèi)蒙、吉林的東北甘草含甘草酸、甘草甙、異甘草甙、甘草香豆酮、甘草西定、甘草利酮、甘草酚等。本研究通過檢測甘草酸、甘草苷、異甘草素、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草素六種主要的化學成分含量，對不同產(chǎn)地的甘草進行了測定。

2.1 標準曲線的繪制

稱取甘草苷對照品 14.8 mg、甘草酸銨對照品 21.2 mg、甘草素對照品18.9 mg、異甘草素17.3 mg、芹糖甘草苷21.0 mg，分別用70%乙醇定容于10 mL 容量瓶中，另稱取芹糖異甘草苷4.8 mg，用70%乙醇定容于5 mL容量瓶中，作為對照品儲備液。分別精密吸取甘草苷儲備液67.6 μL、甘草酸銨儲備液47.2 μL、甘草素儲備液52.9 μL、異甘草素儲備液57.8 μL、芹糖甘草苷儲備液47.6 μL、芹糖異甘草苷104.2 μL，用70%乙醇定容至1 mL，作為系列混合標準溶液。分別進樣10 μL，記錄甘草苷、甘草酸銨、甘草素、異甘草素、芹糖甘草苷和芹糖異甘草苷的峰面積，以峰面積對進樣量(μg)進行回歸，結(jié)果見表2?；旌蠘藴氏盗猩V圖，見圖2。甘草苷、甘草酸銨、甘草素、異甘草素、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷色譜峰理論塔板數(shù)，分別為9千、30萬、6萬、20萬、7千、1萬。

表2 不同產(chǎn)地甘草中甘草酸、甘草苷、異甘草素、芹糖 甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草素的含量比較 (mg/g)

續(xù)表2 不同產(chǎn)地甘草中甘草酸、甘草苷、異甘草素、芹糖 甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草素的含量比較 (mg/g)

2.2 穩(wěn)定性和精密度實驗

取甘肅甘草樣品一份，按照“1.2”項下方法取得供試品溶液，室溫放置，并于0、2、4、6、8、12 h進樣，記錄色譜圖，計算各物質(zhì)的峰面積進行穩(wěn)定性實驗。取甘肅甘草樣品6份，按照“1.2”項下方法取得供試品溶液，同樣實驗條件下進樣，記錄色譜圖，計算各物質(zhì)的峰面積，進行精密度實驗。

六種標準物質(zhì)在上述儀器條件下，在5～30 min全部出峰且峰形尖銳而對稱，測試結(jié)果見圖2至圖6。圖2表示的是六種標準物質(zhì)出峰的先后順序色譜，圖3至圖6分別是甘肅、新疆、內(nèi)蒙、寧夏的甘草樣品的色譜。表2為六種主要成分的檢測結(jié)果。由穩(wěn)定性測試結(jié)果可知，甘草供試品各色譜峰相對保留時間在12 h內(nèi)穩(wěn)定。由精密度實驗測試結(jié)果可知，精密度均符合標準要求。

圖2 甘草酸、甘草苷、異甘草素、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草素六種物質(zhì)色譜

圖3 甘肅甘草樣品的色譜

圖4 新疆甘草樣品的色譜

圖5 內(nèi)蒙甘草樣品的色譜

圖6 寧夏甘草樣品的色譜

3 討論

在測定樣品中，吉林甘草樣品中甘草酸、甘草苷、異甘草素普遍較低，內(nèi)蒙、甘肅、新疆甘草樣品中甘草酸含量較高，而新疆甘草樣品甘草酸含量最高，甘草苷的含量以內(nèi)蒙和甘肅甘草樣品為高，異甘草素含量以內(nèi)蒙甘草樣品為高。新疆和內(nèi)蒙的樣品中芹糖甘草苷含量明顯高于甘肅和吉林的樣品，而甘肅和吉林中芹糖甘草苷含量比較接近，新疆和內(nèi)蒙的樣品中芹糖甘草苷含量比較接近。新疆樣品中的甘草素含量最高，明顯高于其他三地；內(nèi)蒙和吉林樣品的甘草素含量接近，甘肅樣品中甘草素含量最低。四地的芹糖異甘草苷含量相差不大，吉林和甘肅兩地的樣品更為接近。由此可見，在選定的六種物質(zhì)中，東北、華北、西北不同產(chǎn)地的甘草樣品其含量差異很大，并且表現(xiàn)出一定的規(guī)律性和代表性。除此之外，其他甘草的活性成分由于不同地理位置、生長環(huán)境、氣候條件、種植方式的差異，也呈現(xiàn)出相似的特征。這些都可以作為中藥材產(chǎn)地鑒別的參考，可為甘草的規(guī)范化種植提供一定的科學依據(jù)。