周亞男，李宗城，張曉彤，胡成進(jìn)，應(yīng)曉敏，曹源

1.濰坊醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系，山東 濰坊 261053；2.解放軍第九六〇醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷科，山東 濟(jì)南250031；3.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心南院區(qū) 腫瘤學(xué)研究室，北京 100071；4.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）是一種嗜溫嗜鹽的革蘭陰性弧菌，外型為棒狀或弧狀，兼性厭氧，廣泛分布于河海交界處。它屬于機(jī)會(huì)致病菌，主要有2種感染途徑：一是經(jīng)口感染，比如生食帶菌食物等，可導(dǎo)致敗血癥或菌血癥，病死率高達(dá)50%；二是經(jīng)皮膚傷口感染，主要是開放性傷口接觸帶菌物體等，可導(dǎo)致骨髓炎、蜂窩織炎和敗血癥等，如治療不及時(shí)，易導(dǎo)致患者截肢或死亡[1]。在中國(guó)，創(chuàng)傷弧菌的致死率為18%～56%[2-3]。因此，探討創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制，對(duì)于預(yù)防和感染后的治療是非常必要的。

細(xì)菌小 RNA（small RNA，sRNA）是長(zhǎng)度為40～500核苷酸（nt）的非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA），主要位于基因間、編碼基因5'與3'非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR）等，可通過與RNA堿基配對(duì)或靶向蛋白質(zhì)發(fā)揮功能[4]。研究發(fā)現(xiàn)，sRNA參與細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA加工、RNA修飾、mRNA穩(wěn)定和翻譯、蛋白質(zhì)降解、質(zhì)粒復(fù)制以及細(xì)菌感染等過程[5-7]，且對(duì)于細(xì)菌維持體內(nèi)平衡和適應(yīng)生長(zhǎng)變化的能力至關(guān)重要[8]。根據(jù)其主要調(diào)節(jié)機(jī)制，可將sRNA分為5類：調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的 sRNA、順 式 編 碼 sRNA（antisenseRNA，as-RNA）、反 式 編 碼 sRNA（trans-encodedsRNA，trans RNA）、5'UTR調(diào)控元件，以及CRISPR/Cas系統(tǒng)[9]。調(diào)控過程通常涉及伴侶蛋白Hfq（host factor for QB）和 Csr（carbon storage regulator）A[10]，這些蛋白參與sRNA與靶mRNA的相互作用、mRNA翻譯或RNA衰變過程。它們可以通過結(jié)合起始靶位點(diǎn)、隔離核糖體備用位點(diǎn)或者利用RNA酶促進(jìn)mRNA降解來抑制翻譯，還可通過暴露隔離的核糖體結(jié)合位點(diǎn)或掩蔽核糖體切割位點(diǎn)來保護(hù)mRNA從而激活翻譯[11]。因此，在研究功能之前，細(xì)菌sRNA的確定和驗(yàn)證是至關(guān)重要的。

隨著高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的發(fā)展，基于ncRNA基因的全基因組定位及生物信息學(xué)方法被廣泛用于預(yù)測(cè)原核生物中的sRNA，隨后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和Northern印跡等方法進(jìn)行驗(yàn)證[12]。研究表明，創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株基因組由2條圓形染色體組成，大小為5.01 Mb，GC含量為47%，注釋基因4701個(gè)，編碼蛋白4562個(gè)。染色體1包含2980個(gè)編碼序列（coding sequence，CDS）、8個(gè)16S-23S-5S rRNA操縱子拷貝和100個(gè)tRNA；染色體2包含1582個(gè)CDS、1個(gè)rRNA操縱子和11個(gè)tRNA[13]。我們采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA sequencing，RNA-seq）識(shí)別創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O的sRNA，并通過RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料

創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株由韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)Sang Ho Choi教授惠贈(zèng)；海洋培養(yǎng)基2216E購自青島海博生物公司；總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；創(chuàng)傷弧菌sRNA建庫及測(cè)序由武漢生命之美科技有限公司完成。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)及RNA提取

將創(chuàng)傷弧菌的過夜培養(yǎng)物按1∶100稀釋于1 L海洋培養(yǎng)基中，在20℃搖床上使細(xì)胞生長(zhǎng)至靜止期，通過D600nm值測(cè)量生長(zhǎng)。第1個(gè)樣品在2 h（指數(shù)生長(zhǎng)早期，D600nm=0.18）時(shí)收集，然后每2 h收集一次，直至進(jìn)入靜止期（12 h，D600nm=1.91）。每次取樣后將-20℃的7 mL 100%乙醇加入7 mL細(xì)菌培養(yǎng)物中以防RNA降解。4℃離心后，將細(xì)胞沉淀保存于-80℃，直至RNA制備。

將上述樣品進(jìn)行總RNA提取，然后用Smartspec Plus分光光度計(jì)（BioRad公司）測(cè)定D260nm/D280nm值，用1.5%瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性，以保證用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣品RNA合格。

1.3 轉(zhuǎn)錄組建庫及測(cè)序

將每個(gè)樣品的10 μg總RNA用于RNA-seq文庫制備。先用RiboMinus rRNA depletion kit（Ambion公司）去除rRNA，然后制備RNA-seq文庫，用Hiseq 2000測(cè)序儀進(jìn)行100 nt雙端測(cè)序。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

去掉接頭序列和低質(zhì)量reads，得到有效序列。用bowtie容2-nt的錯(cuò)配比對(duì)到創(chuàng)傷弧菌參考基因組中（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/Vibrio_vulnificus_MO6_24_O_uid62243/），然后從每一個(gè)樣品中檢出基因數(shù)，最后檢測(cè)reads在基因組不同區(qū)域的分布和覆蓋度，用RPKM（reads per kilo base of a gene per million reads）[14]分析基因表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 通過測(cè)序獲得數(shù)據(jù)

為了接近自然生長(zhǎng)條件，我們用海洋培養(yǎng)基在20℃條件下培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株。由于許多調(diào)控RNA只在特定條件下表達(dá)，我們收集了創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)過程中從早期指數(shù)增長(zhǎng)期到靜止期6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的菌液，并對(duì)提取的總RNA樣品進(jìn)行ncRNA高通量測(cè)序和mRNA高通量測(cè)序，對(duì)每個(gè)基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。

圖1 創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O基因在染色體上的分布及表達(dá)

總RNA建庫和高通量測(cè)序分析顯示，樣品大片段測(cè)序量為400萬reads，Clean比例大部分在60%左右；樣品小片段測(cè)序量為1612萬reads，Clean比例大部分在84%左右，說明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。染色體1和2共14 087 240 reads，能夠匹配到基因組的共12 927 465 reads，定位在染色體1的有10 031 702 reads，定位在染色體2的有2 410 348 reads。染色體1的長(zhǎng)度為3 194 232 nt，染色體2的長(zhǎng)度為3 194 232 nt。見表1。

表1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝結(jié)果

2.2 2條染色體具有不同的表達(dá)水平

表1顯示，染色體1每個(gè)核苷酸的平均覆蓋度是染色體2的1.63倍，表明在我們的檢測(cè)條件下，染色體1的表達(dá)量高于染色體2。在2條染色體中，定位到注釋基因序列的reads均大于非編碼序列。但是，染色體1中定位到帶注釋序列的reads略高于染色體2，而定位在非編碼序列的reads略低于染色體2。只有2.27%（染色體1）和3.57%（染色體2）的reads定位在順式編碼序列。另外，基因表達(dá)水平采用RPKM值標(biāo)準(zhǔn)化，染色體1和2的RPKM值等于零的CDS分別為0.8%和0.6%，小于5的CDS分別為2.0%和8.9%。

2.3 ncRNA的預(yù)測(cè)

分析結(jié)果顯示，總共獲得了2725個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，我們將reads聚類到可能的轉(zhuǎn)錄本中，并將這些聚類劃分為與可能的調(diào)控RNA相對(duì)應(yīng)的3類，即trans RNA、5'UTR調(diào)控元件和asRNA。最后共發(fā)現(xiàn)102個(gè)trans RNA、1431個(gè)5'UTR調(diào)控元件和59個(gè)asRNA。圖2表示細(xì)菌sRNA在基因組上的位置。

圖2 細(xì)菌sRNA在基因組上的位置

2.4 5'UTR調(diào)控元件的鑒定

分析發(fā)現(xiàn)MOCO_RNA_MOTIF、賴氨酸核糖開關(guān)和甘氨酸核糖開關(guān)為5'UTR調(diào)控元件。而且在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，MOCO_RNA_MOTIF、賴氨酸核糖開關(guān)和甘氨酸核糖開關(guān)在2 h均表達(dá)較高，6 h表達(dá)最低，10 h表達(dá)仍較低，表明這些sRNA在進(jìn)入靜止期后均表達(dá)較少（圖3A）。RT-PCR結(jié)果顯示2、6、10 h時(shí) MOCO_RNA_MOTIF 均 為 100～200 nt，菌液D600nm值分別為0.6、1.7、2.4（圖3B）。

圖3 RT-PCR驗(yàn)證3個(gè)時(shí)間點(diǎn)5'UTR調(diào)控元件

2.5 4種CsrB sRNA的鑒定

經(jīng)鑒定，創(chuàng)傷弧菌有4種CsrB sRNA，均為trans RNA，分別為CsrB1、CsrB2、CsrB3、CsrB4，它們的基因定位見圖4A。RT-PCR結(jié)果顯示3個(gè)時(shí)間 點(diǎn)（2、6、10 h）CsrB1、CsrB2、CsrB3、CsrB4 sRNA的大小為300～500 nt（圖4B）。

圖4 trans RNA驗(yàn)證

2.6 asRNA的鑒定

本研究鑒定出的asRNA VVR19與VVMO6_00972堿基互補(bǔ)，而VVMO6_00972有可能是一個(gè)膜蛋白（圖5A），通過TMHMM跨膜蛋白預(yù)測(cè)程序發(fā)現(xiàn)后者有9個(gè)跨膜域（圖5B）。

3 討論

近年來，創(chuàng)傷弧菌引發(fā)的疾病對(duì)人類造成了極大影響，但其生物學(xué)、基因?qū)W、毒力能力和流行病學(xué)相關(guān)的許多方面仍在探索中[15]。本研究中我們通過對(duì)創(chuàng)傷弧菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析揭示了創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O基因組中sRNA的重要性，鑒定了59個(gè)asRNA、102個(gè)trans RNA和1431個(gè)5'UTR。

圖5 asRNA的鑒定

天然存在的asRNA是可以在特定互補(bǔ)區(qū)域與靶mRNA配對(duì)的小分子。它可以通過抑制引物成熟、阻止激活因子RNA形成、影響mRNA降解從而調(diào)控質(zhì)粒拷貝數(shù)，或者通過轉(zhuǎn)錄衰減、抑制翻譯等影響細(xì)胞功能[16]。例如，MucD_AS作為銅綠假單胞菌的asRNA可以調(diào)節(jié)MucD基因表達(dá)以及誘導(dǎo)生物膜形成[17]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株中asRNA VVR19的表達(dá)從指數(shù)生長(zhǎng)期開始逐步增高，到靜止期后減弱，這表明在MO6-24/O株指數(shù)生長(zhǎng)過程中asRNA VVR19可能發(fā)揮重要作用，但其具體調(diào)控機(jī)制仍須進(jìn)一步探索。

此外，García等報(bào)道，從副溶血弧菌中鑒定出的3種CsrB sRNA基因表達(dá)增加可能與更快碳代謝相關(guān)[18]。在大腸桿菌中，CsrB sRNA是CsrA的拮抗劑，CsrA是碳存儲(chǔ)的核心要素，其抑制糖原合成、分解代謝和糖異生等[19]。因此我們猜想從創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株中鑒定出的4種CsrB sRNA可能與其碳代謝相關(guān)。

核糖體開關(guān)可以控制氨基酸、核苷酸、金屬離子等多種基因。近年來，許多經(jīng)典的核糖體開關(guān)相關(guān)機(jī)制被報(bào)道，例如在單核細(xì)胞增生李斯特菌中發(fā)現(xiàn)2種維生素B12結(jié)合核糖體依賴機(jī)制可以控制丙二醇和乙醇胺分解代謝。另外，核糖體開關(guān)SreA和SreB已被證明具有反式功能，可以控制PrfA表達(dá)。PrfA是單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力因子表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子，核糖體開關(guān)SreA和SreB可與PrfA的5'UTR結(jié)合，降低PrfA轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性或mRNA翻譯，以控制PrfA表達(dá)，從而控制單核細(xì)胞增生李斯特菌的毒力[20]。因此，本研究鑒定出的創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株核糖體開關(guān)可能與毒力調(diào)控相關(guān)，并且在指數(shù)生長(zhǎng)早期相對(duì)表達(dá)最強(qiáng)，這可能是因?yàn)樵谥笖?shù)生長(zhǎng)早期創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株的毒力最強(qiáng)，需要更高水平的核糖體開關(guān)來控制毒力表達(dá)。