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        基于轉(zhuǎn)錄組測序探索創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O小RNA

        2019-07-16 00:59:46周亞男李宗城張曉彤胡成進(jìn)應(yīng)曉敏曹源
        生物技術(shù)通訊 2019年3期
        關(guān)鍵詞:核糖體弧菌毒力

        周亞男,李宗城,張曉彤,胡成進(jìn),應(yīng)曉敏,曹源

        1.濰坊醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系,山東 濰坊 261053;2.解放軍第九六〇醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷科,山東 濟(jì)南250031;3.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心南院區(qū) 腫瘤學(xué)研究室,北京 100071;4.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所,北京 100850

        創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)是一種嗜溫嗜鹽的革蘭陰性弧菌,外型為棒狀或弧狀,兼性厭氧,廣泛分布于河海交界處。它屬于機(jī)會致病菌,主要有2種感染途徑:一是經(jīng)口感染,比如生食帶菌食物等,可導(dǎo)致敗血癥或菌血癥,病死率高達(dá)50%;二是經(jīng)皮膚傷口感染,主要是開放性傷口接觸帶菌物體等,可導(dǎo)致骨髓炎、蜂窩織炎和敗血癥等,如治療不及時(shí),易導(dǎo)致患者截肢或死亡[1]。在中國,創(chuàng)傷弧菌的致死率為18%~56%[2-3]。因此,探討創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制,對于預(yù)防和感染后的治療是非常必要的。

        細(xì)菌小 RNA(small RNA,sRNA)是長度為40~500核苷酸(nt)的非編碼 RNA(non-coding RNA,ncRNA),主要位于基因間、編碼基因5'與3'非翻譯區(qū)(untranslated regions,UTR)等,可通過與RNA堿基配對或靶向蛋白質(zhì)發(fā)揮功能[4]。研究發(fā)現(xiàn),sRNA參與細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA加工、RNA修飾、mRNA穩(wěn)定和翻譯、蛋白質(zhì)降解、質(zhì)粒復(fù)制以及細(xì)菌感染等過程[5-7],且對于細(xì)菌維持體內(nèi)平衡和適應(yīng)生長變化的能力至關(guān)重要[8]。根據(jù)其主要調(diào)節(jié)機(jī)制,可將sRNA分為5類:調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的 sRNA、順 式 編 碼 sRNA(antisenseRNA,as-RNA)、反 式 編 碼 sRNA(trans-encodedsRNA,trans RNA)、5'UTR調(diào)控元件,以及CRISPR/Cas系統(tǒng)[9]。調(diào)控過程通常涉及伴侶蛋白Hfq(host factor for QB)和 Csr(carbon storage regulator)A[10],這些蛋白參與sRNA與靶mRNA的相互作用、mRNA翻譯或RNA衰變過程。它們可以通過結(jié)合起始靶位點(diǎn)、隔離核糖體備用位點(diǎn)或者利用RNA酶促進(jìn)mRNA降解來抑制翻譯,還可通過暴露隔離的核糖體結(jié)合位點(diǎn)或掩蔽核糖體切割位點(diǎn)來保護(hù)mRNA從而激活翻譯[11]。因此,在研究功能之前,細(xì)菌sRNA的確定和驗(yàn)證是至關(guān)重要的。

        隨著高通量測序和生物信息學(xué)的發(fā)展,基于ncRNA基因的全基因組定位及生物信息學(xué)方法被廣泛用于預(yù)測原核生物中的sRNA,隨后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)和Northern印跡等方法進(jìn)行驗(yàn)證[12]。研究表明,創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株基因組由2條圓形染色體組成,大小為5.01 Mb,GC含量為47%,注釋基因4701個(gè),編碼蛋白4562個(gè)。染色體1包含2980個(gè)編碼序列(coding sequence,CDS)、8個(gè)16S-23S-5S rRNA操縱子拷貝和100個(gè)tRNA;染色體2包含1582個(gè)CDS、1個(gè)rRNA操縱子和11個(gè)tRNA[13]。我們采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA sequencing,RNA-seq)識別創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O的sRNA,并通過RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株由韓國首爾國立大學(xué)Sang Ho Choi教授惠贈;海洋培養(yǎng)基2216E購自青島海博生物公司;總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;創(chuàng)傷弧菌sRNA建庫及測序由武漢生命之美科技有限公司完成。

        1.2 細(xì)菌培養(yǎng)及RNA提取

        將創(chuàng)傷弧菌的過夜培養(yǎng)物按1∶100稀釋于1 L海洋培養(yǎng)基中,在20℃搖床上使細(xì)胞生長至靜止期,通過D600nm值測量生長。第1個(gè)樣品在2 h(指數(shù)生長早期,D600nm=0.18)時(shí)收集,然后每2 h收集一次,直至進(jìn)入靜止期(12 h,D600nm=1.91)。每次取樣后將-20℃的7 mL 100%乙醇加入7 mL細(xì)菌培養(yǎng)物中以防RNA降解。4℃離心后,將細(xì)胞沉淀保存于-80℃,直至RNA制備。

        將上述樣品進(jìn)行總RNA提取,然后用Smartspec Plus分光光度計(jì)(BioRad公司)測定D260nm/D280nm值,用1.5%瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性,以保證用于轉(zhuǎn)錄組測序的樣品RNA合格。

        1.3 轉(zhuǎn)錄組建庫及測序

        將每個(gè)樣品的10 μg總RNA用于RNA-seq文庫制備。先用RiboMinus rRNA depletion kit(Ambion公司)去除rRNA,然后制備RNA-seq文庫,用Hiseq 2000測序儀進(jìn)行100 nt雙端測序。

        1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

        去掉接頭序列和低質(zhì)量reads,得到有效序列。用bowtie容2-nt的錯(cuò)配比對到創(chuàng)傷弧菌參考基因組中(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/Vibrio_vulnificus_MO6_24_O_uid62243/),然后從每一個(gè)樣品中檢出基因數(shù),最后檢測reads在基因組不同區(qū)域的分布和覆蓋度,用RPKM(reads per kilo base of a gene per million reads)[14]分析基因表達(dá)量。

        2 結(jié)果

        2.1 通過測序獲得數(shù)據(jù)

        為了接近自然生長條件,我們用海洋培養(yǎng)基在20℃條件下培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株。由于許多調(diào)控RNA只在特定條件下表達(dá),我們收集了創(chuàng)傷弧菌生長過程中從早期指數(shù)增長期到靜止期6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的菌液,并對提取的總RNA樣品進(jìn)行ncRNA高通量測序和mRNA高通量測序,對每個(gè)基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。

        圖1 創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O基因在染色體上的分布及表達(dá)

        總RNA建庫和高通量測序分析顯示,樣品大片段測序量為400萬reads,Clean比例大部分在60%左右;樣品小片段測序量為1612萬reads,Clean比例大部分在84%左右,說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。染色體1和2共14 087 240 reads,能夠匹配到基因組的共12 927 465 reads,定位在染色體1的有10 031 702 reads,定位在染色體2的有2 410 348 reads。染色體1的長度為3 194 232 nt,染色體2的長度為3 194 232 nt。見表1。

        表1 轉(zhuǎn)錄組測序組裝結(jié)果

        2.2 2條染色體具有不同的表達(dá)水平

        表1顯示,染色體1每個(gè)核苷酸的平均覆蓋度是染色體2的1.63倍,表明在我們的檢測條件下,染色體1的表達(dá)量高于染色體2。在2條染色體中,定位到注釋基因序列的reads均大于非編碼序列。但是,染色體1中定位到帶注釋序列的reads略高于染色體2,而定位在非編碼序列的reads略低于染色體2。只有2.27%(染色體1)和3.57%(染色體2)的reads定位在順式編碼序列。另外,基因表達(dá)水平采用RPKM值標(biāo)準(zhǔn)化,染色體1和2的RPKM值等于零的CDS分別為0.8%和0.6%,小于5的CDS分別為2.0%和8.9%。

        2.3 ncRNA的預(yù)測

        分析結(jié)果顯示,總共獲得了2725個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,我們將reads聚類到可能的轉(zhuǎn)錄本中,并將這些聚類劃分為與可能的調(diào)控RNA相對應(yīng)的3類,即trans RNA、5'UTR調(diào)控元件和asRNA。最后共發(fā)現(xiàn)102個(gè)trans RNA、1431個(gè)5'UTR調(diào)控元件和59個(gè)asRNA。圖2表示細(xì)菌sRNA在基因組上的位置。

        圖2 細(xì)菌sRNA在基因組上的位置

        2.4 5'UTR調(diào)控元件的鑒定

        分析發(fā)現(xiàn)MOCO_RNA_MOTIF、賴氨酸核糖開關(guān)和甘氨酸核糖開關(guān)為5'UTR調(diào)控元件。而且在3個(gè)時(shí)間點(diǎn),MOCO_RNA_MOTIF、賴氨酸核糖開關(guān)和甘氨酸核糖開關(guān)在2 h均表達(dá)較高,6 h表達(dá)最低,10 h表達(dá)仍較低,表明這些sRNA在進(jìn)入靜止期后均表達(dá)較少(圖3A)。RT-PCR結(jié)果顯示2、6、10 h時(shí) MOCO_RNA_MOTIF 均 為 100~200 nt,菌液D600nm值分別為0.6、1.7、2.4(圖3B)。

        圖3 RT-PCR驗(yàn)證3個(gè)時(shí)間點(diǎn)5'UTR調(diào)控元件

        2.5 4種CsrB sRNA的鑒定

        經(jīng)鑒定,創(chuàng)傷弧菌有4種CsrB sRNA,均為trans RNA,分別為CsrB1、CsrB2、CsrB3、CsrB4,它們的基因定位見圖4A。RT-PCR結(jié)果顯示3個(gè)時(shí)間 點(diǎn)(2、6、10 h)CsrB1、CsrB2、CsrB3、CsrB4 sRNA的大小為300~500 nt(圖4B)。

        圖4 trans RNA驗(yàn)證

        2.6 asRNA的鑒定

        本研究鑒定出的asRNA VVR19與VVMO6_00972堿基互補(bǔ),而VVMO6_00972有可能是一個(gè)膜蛋白(圖5A),通過TMHMM跨膜蛋白預(yù)測程序發(fā)現(xiàn)后者有9個(gè)跨膜域(圖5B)。

        3 討論

        近年來,創(chuàng)傷弧菌引發(fā)的疾病對人類造成了極大影響,但其生物學(xué)、基因?qū)W、毒力能力和流行病學(xué)相關(guān)的許多方面仍在探索中[15]。本研究中我們通過對創(chuàng)傷弧菌轉(zhuǎn)錄組測序分析揭示了創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O基因組中sRNA的重要性,鑒定了59個(gè)asRNA、102個(gè)trans RNA和1431個(gè)5'UTR。

        圖5 asRNA的鑒定

        天然存在的asRNA是可以在特定互補(bǔ)區(qū)域與靶mRNA配對的小分子。它可以通過抑制引物成熟、阻止激活因子RNA形成、影響mRNA降解從而調(diào)控質(zhì)??截悢?shù),或者通過轉(zhuǎn)錄衰減、抑制翻譯等影響細(xì)胞功能[16]。例如,MucD_AS作為銅綠假單胞菌的asRNA可以調(diào)節(jié)MucD基因表達(dá)以及誘導(dǎo)生物膜形成[17]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株中asRNA VVR19的表達(dá)從指數(shù)生長期開始逐步增高,到靜止期后減弱,這表明在MO6-24/O株指數(shù)生長過程中asRNA VVR19可能發(fā)揮重要作用,但其具體調(diào)控機(jī)制仍須進(jìn)一步探索。

        此外,García等報(bào)道,從副溶血弧菌中鑒定出的3種CsrB sRNA基因表達(dá)增加可能與更快碳代謝相關(guān)[18]。在大腸桿菌中,CsrB sRNA是CsrA的拮抗劑,CsrA是碳存儲的核心要素,其抑制糖原合成、分解代謝和糖異生等[19]。因此我們猜想從創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株中鑒定出的4種CsrB sRNA可能與其碳代謝相關(guān)。

        核糖體開關(guān)可以控制氨基酸、核苷酸、金屬離子等多種基因。近年來,許多經(jīng)典的核糖體開關(guān)相關(guān)機(jī)制被報(bào)道,例如在單核細(xì)胞增生李斯特菌中發(fā)現(xiàn)2種維生素B12結(jié)合核糖體依賴機(jī)制可以控制丙二醇和乙醇胺分解代謝。另外,核糖體開關(guān)SreA和SreB已被證明具有反式功能,可以控制PrfA表達(dá)。PrfA是單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力因子表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子,核糖體開關(guān)SreA和SreB可與PrfA的5'UTR結(jié)合,降低PrfA轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性或mRNA翻譯,以控制PrfA表達(dá),從而控制單核細(xì)胞增生李斯特菌的毒力[20]。因此,本研究鑒定出的創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株核糖體開關(guān)可能與毒力調(diào)控相關(guān),并且在指數(shù)生長早期相對表達(dá)最強(qiáng),這可能是因?yàn)樵谥笖?shù)生長早期創(chuàng)傷弧菌MO6-24/O株的毒力最強(qiáng),需要更高水平的核糖體開關(guān)來控制毒力表達(dá)。

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