徐力紅,林虹君,李高偉，趙飛，尉馳

中國人民解放軍32311部隊，北京 102112

對臨床生物標志物的靈敏、準確檢測是早期疾病診斷面臨的一大挑戰(zhàn)[1-2]。隨著對早期生物標志物超靈敏檢測的需求日益增加，研究人員更加關(guān)注如何創(chuàng)新檢測技術(shù)或信號放大方法來提高檢測靈敏度。對于臨床應(yīng)用，免疫傳感器必須是簡單、廉價和超靈敏的，并能用于檢測患者樣本中微量生物標志物[3-5]。但由于現(xiàn)有傳感器操作復(fù)雜、成本高昂、耗時較長，因此其應(yīng)用受到了較大限制。為了克服這些問題，人們越來越重視開發(fā)新的分析方法來測定超低濃度的分析物和實際樣品[6-9]。

金納米粒子（gold nanoparticles，GNps）作為經(jīng)典的納米載體，具有粒徑可控、制備簡單、導(dǎo)電性好等優(yōu)點。此外，GNps在不破壞待測物生物活性的前提下，易與蛋白質(zhì)結(jié)合[10-13]。自由基聚合反應(yīng)作為一種理想的接枝策略，可以在很多載體表面生成非交聯(lián)、線性聚合物鏈，該方法最大的優(yōu)點是聚合物的厚度具有高可控性[14-19]。

在本研究中，我們將辣根過氧化物酶和抗體按照高比例結(jié)合，研發(fā)出一種新型的由原子轉(zhuǎn)移自由基聚合物（atom transfer radicalpolymer，ATRP）修飾的GNps免疫傳感器，用于檢測高敏感的生物標志物。由于毛發(fā)狀的聚合物鏈為蛋白質(zhì)提供了大量的活性固定位點，所以該方法具有極高的靈敏度[20-23]。

1 材料與方法

1.1 材料

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）樣本、辣根過氧化物酶標記的二抗（HRP-Ab2）均購自Abcam公司；牛血清白蛋白（BSA）、1-乙基-3-（3-二甲基氨）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均購自Sigma-Aldrich公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）為南京市威圣化工貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；檸檬酸鈉為上海創(chuàng)順化工有限公司產(chǎn)品；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20 均購自北京化學(xué)試劑公司；實驗用水為二次蒸餾水。

Milli-Q型純水儀（≥18 MΩ，Millipore公司）；Tecnai G2 20透射電鏡（FEI香港有限公司）；85-2數(shù)顯型恒溫攪拌器（國瑞試驗儀器廠）；Sorvsll Legend Micro 17離心機（Thermo公司）。

1.2 GNps和引發(fā)劑的制備

本研究中GNps按照經(jīng)典方法制備。

引發(fā)劑制備步驟：將11-巰基-1-十一醇溶解于四氫呋喃中，幾分鐘后加入吡啶，然后通入氮氣，將混合物冰浴30 min，最后加入2-溴-異丁基溴，繼續(xù)攪拌，4 h后將反應(yīng)液過濾、干燥，即得到引發(fā)劑，儲存與4℃待用。GNps的透射電鏡圖像如圖1所示。

圖1 GNps的透射電鏡圖

1.3 ATRP修飾GNps

將GNps放入EP管中，在旋轉(zhuǎn)儀上振搖約12 h，用甲醇洗滌3次，加入葡萄糖和引發(fā)劑，攪拌、過夜，即得到GNps-ATRP[24-26]。GNps-ATRP的透射電鏡圖像如圖2所示。

圖2 GNps-ATRP的透射電鏡圖

1.4 GNps-ATRP-（Ab2+HRPs）的制備

首先，將乙二胺加到GNps溶液中，將混合液置于80℃；其次，將含戊二醛的PBS溶液加到以上溶液中，在GNps表面即得到醛基；第三步，將氰化鈉加入Ab2和用PBS溶液制備的HRPs溶液中，在Tris-HCl緩沖液中反應(yīng)24 h，將反應(yīng)液放置于PBS溶液中，4℃過夜；最后，用Tris-HCl緩沖液洗滌3次，即得GNps-ATRP-（Ab2+HRPs）。制作過程示意圖見圖3。

2 結(jié)果與討論

2.1 新方法評價

以CRH為模型分析物，對新方法的性能進行考察。CRH是參與應(yīng)激反應(yīng)的小分子肽激素和神經(jīng)遞質(zhì)，主要由哺乳動物腦組織下丘腦室旁核神經(jīng)元合成和分泌。高CRH水平與急性高原反應(yīng)（acute mountain sickness，AMS）的發(fā)生直接相關(guān)[27]，血漿中CRH水平的高低對預(yù)測AMS的發(fā)生具有重要的參考意義。因此，該數(shù)值可以指導(dǎo)將要去高空旅行或工作的人員采取必要的預(yù)防措施，使危害降到最低。由于血液檢測較為復(fù)雜，且血液中干擾因素太多，對檢測的準確性有較大影響，所以我們采取對唾液中的CRH進行測量。眾所周知，唾液樣本容易獲得，且含有較少的干擾物。但唾液中CRH的含量明顯低于血漿中CRH的含量，因此，提高免疫傳感器的靈敏度就是檢測的關(guān)鍵所在。

首先，將受試者唾液中的CRH按不同比例稀釋，分別用傳統(tǒng)的免疫傳感器和新改良的免疫傳感器檢測。然后，將制備好的樣品和2種不同的復(fù)合物Ab2-HRPs和GNps-ATRP-（Ab2-HRPs）孵育后，測量2種免疫傳感器的電流響應(yīng)。接下來，對影響免疫傳感器性能的條件進行優(yōu)化，并進行選擇性和干擾性考察，最后利用新型免疫傳感器對人唾液樣本進行評價。

圖3 免疫傳感器原理圖

采用傳統(tǒng)方法和新建立方法檢測相同濃度梯度的CRH樣本，分別繪制工作曲線。傳統(tǒng)方法的線性范圍為1～300 pg/mL，檢測限為1 pg/mL（圖4）；新方法的檢測線性范圍為0.5～250 fg/mL，檢出限為0.5 fg/mL（圖5）。因此，由于引入了ATRP修飾的GNps，使得與Ab2結(jié)合的HRP大量增加，從而實現(xiàn)了超高的檢測靈敏度。為了考察新方法的可重復(fù)性，進行了3次獨立性實驗，結(jié)果表明改進后的方法具有較高的重現(xiàn)性。

圖4 Ab2-HRPs用于傳統(tǒng)免疫傳感器檢測反應(yīng)

圖5 GNps-ATRP-（Ab2-HRPs）用于新的免疫傳感器檢測反應(yīng)

2.2 結(jié)論

通過引入ATRP修飾的GNps進行目標蛋白質(zhì)檢測，研制出一種可重復(fù)、超靈敏、穩(wěn)定的新型免疫傳感器。新方法的檢測限為0.5 fg/mL，是傳統(tǒng)免疫傳感器方法的2000倍。新的檢測策略有望推廣到治療監(jiān)測和臨床疾病篩查領(lǐng)域。改進后的免疫傳感器為納米材料在免疫傳感中的應(yīng)用開辟了新的途徑，在未來的臨床試驗或藥物篩選中具有廣闊的應(yīng)用前景。