楊鏗，蔣魁，洪敏娜，徐創(chuàng)文，陳海誼，胡曉娟，曹煜成，楊鶯鶯

(中國水產科學研究院南海水產研究所，農業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣州 510300)

酵素菌(BYM)的研究始于20世紀初期日本柴田欣司氏嘗試用微生物發(fā)酵化肥。后來日本專家島本覺進行了深入研究，分離出3類24種有益菌，并按一定比例制成酵素菌原菌。這3類有益菌分別為細菌(Bacteria，B)、酵母菌(Yeast，Y) 和絲狀菌(Mold，M)，因此，酵素菌簡稱為BYM[1]。目前酵素菌技術已經從水產養(yǎng)殖中的應用擴大至凈化水質、改良底質、抑制病菌、提高水產動物的抗病能力、提高養(yǎng)殖產量和增加經濟效益等領域，是一種很好的調水劑和飼料添加劑[2-3]。

活性酵素以麩皮為主要原料，可通過多種有益微生物共同作用發(fā)酵制得，富含乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等有益菌及多種酶類和有機酸。陳景明[4]在飼料中添加不同濃度的活性酵素飼養(yǎng)中華倒刺鲃(SpinibarbusSinensis)的研究發(fā)現(xiàn)，活性酵素能夠很好地促進中華倒刺鲃的生長，并對其肝胰臟淀粉酶的最適pH有較大影響。乳酸菌已經在人類食品、養(yǎng)殖動物飼料和動保產品中得到廣泛應用，具有促進消化吸收、改善腸道的作用[5-6]。酵母菌發(fā)酵產物富含多種酶與營養(yǎng)物質，可被養(yǎng)殖動物吸收利用，加快其生長速度[7-9]，常作為營養(yǎng)物質添加到飼料中。芽孢桿菌能夠分解養(yǎng)殖池殘餌、死藻和糞便等，并將大分子有機物殘渣分解為小分子有機物，供養(yǎng)殖池藻類利用，調節(jié)養(yǎng)殖池氨氮含量和亞硝酸氮含量，保持水質穩(wěn)定[10-12]。

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦，原產于太平洋沿岸水域秘魯北部至墨西哥桑諾拉一帶，1988年由張偉權教授引入中國，1994年批量育苗成功[13]。現(xiàn)已成為全國沿海主要養(yǎng)殖品種之一，內陸地區(qū)也開始大量養(yǎng)殖，2017年產量已達到108萬t，是推動養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要品種之一。目前關于凡納濱對蝦的研究主要集中于基因改良[14-17]和病害防治[18-20]，而關于使用生物發(fā)酵技術拌料投喂改善養(yǎng)殖環(huán)境和促進生長的研究卻少見報道。目前，在凡納濱對蝦的養(yǎng)殖過程中，由水質下降而引發(fā)病害爆發(fā)的現(xiàn)象較為常見，已經嚴重影響蝦產業(yè)的發(fā)展。因此，尋求一種有效改善蝦產業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境和促進生長的方法非常必要。

本研究將一款由多種復合菌共同發(fā)酵而成的固體發(fā)酵產品，應用于室內工廠化養(yǎng)殖凡納濱對蝦過程，研究其對養(yǎng)殖池水質的溶解氧(DO)、pH、氨氮含量、亞硝酸氮含量及對蝦生長等指標的影響，旨在探討有效促其生長并可調節(jié)水質的養(yǎng)殖方式，為促進凡納濱對蝦養(yǎng)殖產業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

主要儀器包括：美國YSI Pro Plus手持式多參數(shù)水質分析儀(美國YSI儀器公司)；AL204 型電子秤(美國丹佛儀器公司)；HACH DR/2400型分光光度計(美國HACH公司)。

活性酵素：采用固體發(fā)酵技術，以麩皮為主要原料，通過多種有益微生物共同作用發(fā)酵所得，富含乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等有益菌和蛋白酶、淀粉酶、氨基酸、有機酸等有益活性物質，由廣州市欣海利生生物科技有限公司提供。

實驗用蝦苗：0.8 cm凡納濱對蝦小蝦苗，800 m2室內工廠化水泥池9個，由廣東冠利達海洋集團提供。

1.2 方法

實驗過程在室內工廠化水泥池進行，實驗周期為45 d。每個水泥池面積為800 m2，水深1 m，每池的投苗量為30萬尾，共使用9個養(yǎng)殖池(1個對照組和實驗組A、B，每組3個平行實驗)。每日投喂餐數(shù)為3餐，時間分別是06：00，11：30，17：00。根據(jù)對蝦生長階段不同，相應地改變投料比例，即分別使用不同的飼料(0號料、1號料和2號料)：在養(yǎng)殖前15天, 對照組和實驗組A、B均投喂0號料；在第16～40天, 對照組和實驗組A、B均投喂1號料；在第40～45天, 對照組和實驗組A、B均投喂2號料。自蝦苗入池第2天開始投喂0號蝦苗專用料，每日3餐，按照每餐每10萬尾投喂1 kg的標準進行，取每餐投料總量1%飼料放在料臺上，用于判斷對蝦吃料情況，其余部分投喂到整池中。若蝦苗在1.5 h內把料臺的1%量全部吃完，每餐即增加投料量5%；若未在1.5 h內把料臺的1%量吃完，則不增加投喂量。實驗組為在飼料總量不變的情況下飼料拌酵素投喂，比例見表1。

表1 試驗分組設計Tab.1 Test grouping design

注：0號料酵素和飼料的質量比為1∶1，1號料酵素和飼料的質量比為1∶4，2號料酵素和飼料的質量比為1∶8。

1.3 生長指標測定

每15天于每個池塘中隨機抽取30尾蝦，將蝦置于濾紙上，吸干水分，再用直尺及電子天平稱量其體長、體重。

式(1)

1.4 水質指標測定

常規(guī)水質檢測：每天利用YSI水質檢測儀檢測養(yǎng)殖池水溫、DO、pH值等指標。

氨氮含量、亞硝酸氮含量檢測：每3天采集對蝦養(yǎng)殖池水樣，在養(yǎng)殖池四角及中間位置設5個采樣點，采取水面下50 cm水樣，將5個水樣混勻后，經0.45 μm濾膜過濾，使用HACH速測法(rapid detection method，RDM)進行檢測，以HACH分光光度計為檢測平臺，使用HACH配套試劑包，檢測對蝦養(yǎng)殖池水體氨氮含量和亞硝酸氮含量[21]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤(Mean±SD)表示，用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，兩組間使用LSD法比較，P<0.05 表示差異顯著[22]。

2 結果分析

2.1 對蝦生長情況

活性酵素拌料投喂對凡納濱對蝦生長的影響如圖1所示，對蝦初均重為(0.08±0.01)g，投喂45 d后，對照組終均重為(0.47±0.01)g，而實驗組A、B終均重分別是(0.84±0.02)g和(0.65±0.01)g，2個實驗組的終均重均顯著高于對照組(P<0.05)。實驗組A(962.02±13.55)%和實驗組B(726.58±16.04)%的增重率均顯著高于對照組(498.73±17.38)%(P<0.05)；實驗組A和B的體長分別為(5.50±0.14)cm和(4.70±0.15)cm，均顯著高于對照組(4.00±0.20)cm(P<0.05)。添加活性酵素的實驗組A、B在終均重、增重率和終體長均顯著高于對照組(P<0.05)，且實驗組A顯著高于實驗組B(P<0.05)。活性酵素本身富含營養(yǎng)，經對蝦攝食后，其所富含的乳酸菌、酵母菌能促進對蝦的消化吸收，有利于提高飼料轉化率，加快對蝦的生長速度。

圖1 活性酵素對凡納濱對蝦生長的作用(n=3)A:增重率；B：終均重；C：終體長。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。誤差線僅代差異性，標準誤請見具體數(shù)值。Fig.1 Effect of active enzyme on the growth of Litopenaeus vannamei(n=3)A:Weight gain rate；B：Final average weight；C：Final average length. Different lowercase letters indicate statistically significant differences(P<0.05).Error bars only represent differences, standard error of mean are given in specific values.

2.2 養(yǎng)殖池水氨氮、亞硝酸氮含量分析

如圖2所示，對照組水中氨氮含量變化幅度大，在實驗開始的第3天，氨氮含量高達(2.70±0.03)mg/L，隨后氨氮含量也起伏波動明顯，超出0.5 mg/L的安全濃度水平[23]，說明水質不穩(wěn)定。而2個實驗組A、B在整個45 d的實驗周期中，氨氮含量在前3天內升高至(2.11±0.03)mg/L，后下降并一直處于低于0.5 mg/L的安全濃度范圍內，表明水中氨氮含量相對穩(wěn)定。在對養(yǎng)殖池開始投料后，養(yǎng)殖池中殘餌、糞便等有機質增多，而養(yǎng)殖前期養(yǎng)殖池藻類及有益菌數(shù)量較少，尚不能完全分解利用養(yǎng)殖池殘餌糞便等，且養(yǎng)殖池前期未換水，造成養(yǎng)殖池氨氮含量較高。隨著實驗組活性酵素的使用，有益菌形成優(yōu)勢，開始分解利用養(yǎng)殖池中的大量有機物，從而穩(wěn)定了養(yǎng)殖池氨氮含量。在12～45 d期間，2個實驗組氨氮含量穩(wěn)定，且顯著低于對照組(P<0.05)，實驗組A、B間無顯著差異(P>0.05)。

對照組水中亞硝酸氮含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，養(yǎng)殖6 d時，亞硝酸氮含量為(0.12±0.01)mg/L，稍高于安全濃度(0.1 mg/L)；養(yǎng)殖12 d后，亞硝酸氮含量達到(0.23±0.01)mg/L，隨后下降，但在養(yǎng)殖27 d時，達到另一個高峰(0.31±0.01)mg/L；整個實驗過程內，自第6天起，亞硝酸氮含量持續(xù)高于0.1 mg/L的安全濃度水平[23]。當養(yǎng)殖池亞硝酸鹽含量高時，為保證對蝦健康，養(yǎng)殖企業(yè)會采取適當?shù)拇胧┙档蛠喯跛岬?，故而出現(xiàn)含量暫時降低的趨勢，但隨著養(yǎng)殖時間的延長，對照組養(yǎng)殖池水中的亞硝酸氮含量總體呈現(xiàn)波浪式上升趨勢。而2個實驗組全程亞硝酸氮含量均無明顯波動，始終低于0.1 mg/L的安全濃度(圖2)。若養(yǎng)殖池中存在大量死藻、殘餌等殘留物，會導致養(yǎng)殖池氨氮含量升高，經過養(yǎng)殖池中進一步氧化后生成亞硝酸氮，從而影響?zhàn)B殖正常生長，造成養(yǎng)殖動物中毒[24]。本實驗中，投喂含活性酵素的實驗組所在養(yǎng)殖池水中亞硝酸含量始終低于對照組，且維持在低于安全濃度(0.1 mg/L)的范圍內，說明活性酵素能夠分解養(yǎng)殖池死藻、殘餌等，有助于調節(jié)養(yǎng)殖池亞硝酸含量，穩(wěn)定水質。

2.3 養(yǎng)殖池水溫度、溶解氧、pH分析

結果顯示，3組養(yǎng)殖池DO都處于10～13 mg/L的高濃度水平，溫度范圍為19～23 ℃，pH為7.5～8.4。實驗期間，對照組與實驗組的此3項重要指標均處于對蝦最適生長范圍內(圖3)，因活性酵素所含乳酸菌、酵母菌，生長代謝不消耗或少消耗養(yǎng)殖池中氧氣，拌料投喂量少，產酸較少，故對養(yǎng)殖池DO、pH無顯著影響。

圖2 活性酵素對養(yǎng)殖池氨氮含量(A)和亞硝酸氮含量(B)的影響(n=3)Fig.2 Effects of active enzyme on ammonia nitrogen(A) and nitrite concentration(B) in the pond(n=3)

3 討論

3.1 適量活性酵素促進凡納濱對蝦的生長

在水產和畜禽養(yǎng)殖中，酵素菌已廣泛應用在飼料添加劑和拌料投喂中，可有效改善養(yǎng)殖動物腸道環(huán)境、促進消化吸收并提高其攝食率[25]。楊濤等[26]開展了利用酵素菌技術降低養(yǎng)蝦成本、縮短養(yǎng)蝦周期的研究，實驗發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)蝦餌料系數(shù)為0.52時，比一般養(yǎng)蝦餌料系數(shù)降低50%；養(yǎng)殖周期為60 d，達到比常規(guī)養(yǎng)蝦時間縮短一半的效果，說明酵素菌可有效促進對蝦快速生長。本研究中，對照組養(yǎng)殖池水質不穩(wěn)定，對蝦生長速度相對較慢；而當使用活性酵素拌料投喂凡納濱對蝦時，拌料2餐和拌料3餐的兩個實驗組的終均重、增重率和終體長均顯著高于對照組，促生長作用顯著，且拌料2餐對促進凡納濱對蝦生長效果最好。究其原因，可能是在拌3餐酵素時，對蝦攝食到的飼料蛋白過少，不足以滿足對蝦生長需求；而拌料2餐酵素時，對蝦既可攝食到足夠的蛋白，滿足自身生長所需，添加的活性酵素又能夠促進對蝦消化吸收，因此對凡納濱對蝦的生長表現(xiàn)出較好的促進作用?；钚越退亟泴嶒灆z測含有大量的乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌，乳酸菌含量為9×108cfu/g，酵母菌含量為3.5×106cfu/g，芽孢桿菌含量為4×107cfu/g，粗蛋白含量為 9.55%。這些有益菌被對蝦食用后，可在對蝦腸道內形成有益菌優(yōu)勢，抑制有害菌生長，降低發(fā)病率[27]。發(fā)酵后的產物富含蝦青素、蛋白酶、淀粉酶和氨基酸等有益活性物質，可促進消化吸收，加快對蝦生長速度[2]。

3.2 活性酵素具有調節(jié)改善養(yǎng)殖池水質的作用

工廠化養(yǎng)殖是指采用自動化或半自動化的室內高密度養(yǎng)殖系統(tǒng)，通過一系列的措施控制各項水質因子，以達到保持水質穩(wěn)定，提高產量、降低風險的目的[28-29]。相比于傳統(tǒng)外塘大水面低密度養(yǎng)殖的時間長、效益低等不足，工廠化養(yǎng)殖模式更科學、環(huán)保和穩(wěn)定，且經濟效益更好[30]，是一種可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)良養(yǎng)殖模式[31]。但工廠化養(yǎng)殖對蝦，在養(yǎng)殖過程中養(yǎng)殖池中產生的氨氮、亞硝酸氮含量一直是阻礙養(yǎng)殖成功率上升的主要因素。水產養(yǎng)殖對于氨氮含量的要求是低于0.5 mg/L，亞硝酸氮含量低于0.1 mg/L，在此條件下對蝦能健康生長，超過這個含量水平，對蝦即會出現(xiàn)厭食、活力下降及亞硝酸氮中毒等現(xiàn)象，嚴重時會造成對蝦大量死亡。目前各種除氮措施紛呈，效果存在差異[32]。水體環(huán)境質量下降是引起各種病害發(fā)生的主要因素，因此，提高養(yǎng)殖成功率必須從根本上改善養(yǎng)殖池環(huán)境[33-35]。

圖3 活性酵素對養(yǎng)殖池DO(A)、溫度(B)和pH值(C)的影響(n=3)Fig.3 Effects of active enzyme on DO (A), temperature (B) and pH in the pond (C)(n=3)

凡納濱對蝦最適生長的環(huán)境是：pH為7.2～8.8，DO高于4.0 mg/L，氨氮含量低于0.5 mg/L，亞硝酸氮含量低于0.1 mg/L[13]。DO過低、氨氮或亞硝酸氮含量過高都會造成對蝦厭食、中毒，引發(fā)肝胰臟壞死等，嚴重時會造成對蝦死亡[13]。本研究中，將活性酵素應用到養(yǎng)殖池，能夠穩(wěn)定養(yǎng)殖池的pH值于7.5～8.4范圍之間，3組養(yǎng)殖池DO均處于10～13 mg/L的高濃度水平，對DO無明顯影響，這與何沅濱等[36]研究芽孢桿菌在養(yǎng)殖養(yǎng)殖池中對水質的影響結果相似?；钚越退厥嵌喾N有益菌共同發(fā)酵后產物，拌飼料投喂，對養(yǎng)殖池的DO無明顯的影響，能穩(wěn)定養(yǎng)殖池pH，改良水質。

氨氮和亞硝酸氮含量是直接影響對蝦健康的重要指標，氨氮和亞硝酸氮含量過高，會引起對蝦中毒，吃料慢，甚至死亡的情況[37-38]。在養(yǎng)殖的45 d內，對照組氨氮、亞硝酸氮含量不穩(wěn)定，超出安全濃度范圍，分別高達(2.70±0.03)mg/L和(0.31±0.01)mg/L；而使用活性酵素的A、B實驗組，水中亞硝酸氮含量均未出現(xiàn)過高濃度，一直保持在安全質量濃度0.1 mg/L內。氨氮含量在最初3 d升高后，隨著活性酵素的使用而迅速降低，保持在安全質量濃度范圍0.5 mg/L內，實驗組A和B對養(yǎng)殖池水氨氮、亞硝酸氮含量的影響無明顯差異。活性酵素富含乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌，對氨氮和亞硝酸氮含量具有顯著的緩解作用，可穩(wěn)定養(yǎng)殖池水質[39]?；钚越退匕枇贤段沟金B(yǎng)殖池，部分被對蝦攝食到體內，促進消化吸收；部分溶解到養(yǎng)殖池中，補充養(yǎng)殖池有益菌，形成有益菌優(yōu)勢，故能改善養(yǎng)殖池水質環(huán)境?；钚越退刂杏幸婢坝幸婊钚晕镔|在拌料投喂中具體的溶失量，及其對水質參數(shù)的影響有待于進一步研究探討。

4 結論

本研究表明，在養(yǎng)殖密度低于375尾/m3的室內養(yǎng)殖養(yǎng)殖池中，每天投喂3餐，早晚拌料2餐活性酵素，可顯著降低水中氨氮、亞硝酸氮含量，能夠調節(jié)改善水質，并能夠顯著增加凡納濱對蝦的體重和體長，對凡納濱對蝦的促生長作用明顯。綜上，活性酵素是一種新型的固體生物發(fā)酵產物，是水產養(yǎng)殖業(yè)安全、健康和高效的水產動保產品。