林麗聰

(福建省淡水水產(chǎn)研究所，福州 350002)

丁香酚，分子式為C10H12O2，化學(xué)名為2-甲氧-4-丙烯基酚，是一種香料，對(duì)魚(yú)有強(qiáng)烈的麻醉作用，因其價(jià)廉易得，且能夠快速?gòu)难汉徒M織中排出等優(yōu)點(diǎn)[1]，日本、新西蘭和澳大利亞等國(guó)將丁香酚列為安全可靠的漁用麻醉劑[2-3]，但其安全性仍存在一定爭(zhēng)議。據(jù)歐洲食品安全局(EFSA)報(bào)告稱，丁香酚具有肝毒性，可能會(huì)造成肝臟損傷[4]；美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)計(jì)劃(NTP)認(rèn)為丁香酚屬于可疑致癌物質(zhì)[5]，因此，美國(guó)和加拿大迄今為止未批準(zhǔn)丁香酚類化合物為合法的漁用麻醉劑[6-7]。日本雖允許丁香酚作為漁用麻醉劑使用，但規(guī)定其最高殘留限量(MRL)為0.05 mg/kg[8]。中國(guó)相關(guān)部門(mén)至今并沒(méi)有批準(zhǔn)丁香酚類漁用麻醉劑應(yīng)用于水產(chǎn)品，但據(jù)相關(guān)調(diào)研表明，鮮活水產(chǎn)品流通環(huán)節(jié)常用丁香酚作為麻醉劑[9]。

羅非魚(yú)(Oreochromismossambicus)屬熱帶魚(yú)類，因具有生長(zhǎng)快、食性廣、繁殖力強(qiáng)、群體產(chǎn)量高、對(duì)環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、抗病力強(qiáng)和肉質(zhì)細(xì)膩鮮美等特點(diǎn)，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)向全世界推薦養(yǎng)殖的水產(chǎn)優(yōu)良品種，養(yǎng)殖區(qū)域已遍布85個(gè)國(guó)家和地區(qū)，成為國(guó)際上養(yǎng)殖最廣泛的魚(yú)類之一。受氣候與地理?xiàng)l件的影響，中國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖呈現(xiàn)明顯南多北少的現(xiàn)象。南方地區(qū)的廣東省、廣西壯族自治區(qū)、海南省、福建省及云南省得益于氣候條件，羅非魚(yú)養(yǎng)殖發(fā)展迅速，占據(jù)了全國(guó)產(chǎn)量的絕大部分。羅非魚(yú)大部分以鮮活運(yùn)輸?shù)姆绞戒N往四川、新疆、北京及上海等地。對(duì)于商家來(lái)講，越是鮮活、質(zhì)量好的水產(chǎn)品越能獲得更高的利潤(rùn)，但在水產(chǎn)品的長(zhǎng)途運(yùn)輸過(guò)程中，生物易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，而應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引起水產(chǎn)品肉質(zhì)的損傷，甚至導(dǎo)致死亡，死亡后的水產(chǎn)品從價(jià)值到口感都大打折扣。麻醉劑因具有鎮(zhèn)靜作用而被應(yīng)用于水產(chǎn)品的?；钸\(yùn)輸中。2013年，北京市某水產(chǎn)市場(chǎng)使用丁香油水門(mén)汀(含丁香酚)運(yùn)輸活魚(yú)，經(jīng)媒體曝光后引起廣泛關(guān)注[10]。由于缺乏丁香酚毒理學(xué)、藥理學(xué)及其藥物代謝動(dòng)力學(xué)方面的研究，丁香酚是否可用和具體用量，其作為食物被麻醉后對(duì)人體產(chǎn)生的具體影響，已成為消費(fèi)者關(guān)注的話題[11]。因此，急需開(kāi)展丁香酚在羅非魚(yú)中的殘留檢測(cè)技術(shù)研究以及深入的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

目前，關(guān)于魚(yú)、蝦、蟹和水體中丁香酚類化合物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[12-16]、氣相色譜法[17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9,18-20]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3,21-25]等。其中，高效液相色譜法和氣相色譜法在測(cè)定復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)，容易受干擾，且屬常量分析，檢測(cè)限高[12-17]。而色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有較高特異性，能較好地解決復(fù)雜基質(zhì)樣品雜質(zhì)干擾的問(wèn)題，但采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，丁香酚會(huì)在96 h后降解[23]?，F(xiàn)有研究多是集中在水產(chǎn)品肌肉中丁香酚殘留量的研究，其方法大多操作復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，而對(duì)血漿中丁香酚的殘留檢測(cè)研究較少。且國(guó)內(nèi)外暫未見(jiàn)采用UPLC-MS/MS對(duì)羅非魚(yú)血漿中丁香酚殘留檢測(cè)的研究。因此，本研究探討應(yīng)用UPLC-MS/MS檢測(cè)羅非魚(yú)血漿中丁香酚的殘留；同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化羅非魚(yú)肌肉中的丁香酚殘留檢測(cè)方法，旨在為完善水產(chǎn)品中丁香酚殘留檢測(cè)方法提供支持，也可為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法的制訂提供參考依據(jù)，保障羅非魚(yú)的食品安全。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器包括：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(WatersTQ-XS)；Waters UPLC BEH C18色譜柱(50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)；HLB固相萃取柱(Waters Oasis 6CC，200 mg)；濾膜(有機(jī)相尼龍0.22 μm微孔濾膜)以及超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；旋渦振蕩器(德國(guó)IKA公司)；電子天平(德國(guó)Sartorius公司)等。

主要試劑包括：丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(外標(biāo)物，純度≥98%，北京百靈威科技有限公司)；丁香酚-D3標(biāo)準(zhǔn)品(內(nèi)標(biāo)物，純度≥98%，美國(guó)Accustandard公司)；甲醇、乙腈均為色譜純(美國(guó)Fisher公司)，正己烷為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成100.0 μg/mL的貯備液；經(jīng)甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，存于-20 ℃冰箱(保存3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定)。使用時(shí)用甲醇配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

準(zhǔn)確稱取2.0 mg丁香酚-D3(內(nèi)標(biāo)物)，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成0.2 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，存于-20 ℃冰箱。使用時(shí)用甲醇稀釋成20 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 血漿前處理

用移液器準(zhǔn)確移取400 μL血漿樣品，加入800 μL甲醇，渦旋混勻5 min，于13 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)樣。

1.2.3 肌肉前處理[9]

將樣本打成勻漿，稱取2.00 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入20 μg/L丁香酚-D3內(nèi)標(biāo)物20 μL，加入5 mL正己烷，旋渦振蕩5 min后超聲10 min，以9 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液，殘?jiān)? mL正己烷按上述步驟重復(fù)提取1次，合并2次提取液，置于40 ℃水浴中，氮吹至近干，用3 mL 40%甲醇溶液復(fù)溶，9 000 r/min離心5 min，待上樣。

用4 mL甲醇和4 mL水，活化HLB固相萃取柱，上樣，用3 mL 40%甲醇溶液淋洗之后用4 mL甲醇洗脫，洗脫液過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)。

1.2.4 液相色譜條件

采用Waters UPLC BEH C18色譜柱；進(jìn)樣量5 μL；柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min。流動(dòng)相A為0.1%氨水，流動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序?yàn)椋?～0.5 min，25%B；0.5～2.5 min，25%B～95%B；2.5～3 min，95%B；3～4.5 min，95%B～25%B；4.5～5 min，25%B。

1.2.5 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源，負(fù)離子模式(ESI-)；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；毛細(xì)管電壓1.48 kV，錐孔電壓29 V，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量1 000 L/h，碰撞氣流速0.15 mL/min。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)及條件見(jiàn)表1。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6份空白樣品(血漿或肌肉)分別加入相應(yīng)體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成丁香酚含量分別為1.0、3.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg/L的血漿樣品和1.0、3.0、5.0、10.0、50.0和90.0 μg/kg的肌肉樣品，分別按1.2.2及1.2.3方法對(duì)樣品處理后，計(jì)算血漿和肌肉的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.7 檢出限與定量限確定

取空白血漿添加丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2方法處理；取空白肌肉添加丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，按1.2.3方法處理，每個(gè)濃度做6組平行試驗(yàn)。

1.2.8 方法回收率與精密度測(cè)定

取空白血漿進(jìn)行3個(gè)水平的添加，丁香酚的添加水平分別為2.0、4.0和20.0 μg/L，每個(gè)水平做6個(gè)平行樣品，按1.2.2方法處理；取空白肌肉進(jìn)行3個(gè)水平的添加，丁香酚的添加水平分別為2.0、4.0和20.0 μg/kg，每個(gè)水平做6個(gè)平行樣品，按1.2.3方法處理，計(jì)算回收率和精密度。

表1 丁香酚的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜條件參數(shù)Tab.1 MRM ion pairs and mass spectral parameters for eugenol

注：其中“*”為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的選擇

在實(shí)驗(yàn)前期，參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]，羅非魚(yú)血漿和肌肉的丁香酚含量均采用外標(biāo)法來(lái)測(cè)定。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血漿前處理步驟簡(jiǎn)單，只需提取和離心過(guò)濾，采用外標(biāo)法加標(biāo)試驗(yàn)，丁香酚回收率即可大于97%，滿足檢測(cè)要求；而肌肉的前處理，由于需要過(guò)HLB固相萃取柱，會(huì)有部分丁香酚被淋洗，采用外標(biāo)法加標(biāo)試驗(yàn)，其回收率只有70%左右。為了使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確，參考相關(guān)內(nèi)標(biāo)法文獻(xiàn)[9,22]，本實(shí)驗(yàn)重新建立了內(nèi)標(biāo)法，進(jìn)行肌肉中丁香酚回收率實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)回收率大于90%，滿足檢測(cè)要求。因此，本研究中確定分別以外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法測(cè)定羅非魚(yú)血漿和肌肉中的丁香酚殘留。

2.1.2 淋洗液濃度的優(yōu)化

在不加內(nèi)標(biāo)的情況下，分別比較了不同體積比的甲醇溶液淋洗效果(圖1)，結(jié)果顯示，當(dāng)甲醇體積比低于40%時(shí)，不能有效淋洗基質(zhì)，回收率較低；當(dāng)甲醇體積比高于40%，可以有效去除丁香酚干擾基質(zhì)，但同時(shí)隨著甲醇體積比的提高，丁香酚被洗脫的可能性也提高。因此，為了保證洗脫基質(zhì)，同時(shí)保證丁香酚不被洗脫，本實(shí)驗(yàn)選用40%甲醇溶液作為淋洗液。

圖1 不同體積比甲醇對(duì)回收率的影響(n=3)不同字母(a-c)之間差異顯著(P>0.05)。下同。Fig.1 Effects of different volume proportion of methanol on recovery rates(n=3)Significant difference in different letters(a-c，P<0.05).The same below.

2.1.3 洗脫液體積的優(yōu)化

取HLB固相萃取柱，活化后，添加50 μg/L的丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過(guò)淋洗后，用甲醇洗脫，每添加1 mL洗脫液收集一次，比較不同洗脫體積的回收率。結(jié)果顯示，1 mL的甲醇洗脫液可以洗脫出78%左右的丁香酚，在第4次1 mL洗脫時(shí)，丁香酚回收率達(dá)峰值，再次添加淋洗液回收率無(wú)顯著差異(P>0.05)。因此，確定使用洗脫液體積為4 mL(圖2)。

圖2 洗脫體積對(duì)回收率的影響(n=3)Fig.2 Effects of different elution volume on recovery rates(n=3)

2.1.4 色譜條件的優(yōu)化

為了使丁香酚色譜條件達(dá)到最佳，分別選取了BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50.0 mm)和HSS T3色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×50.0 mm)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，HSS T3色譜柱峰形較差，峰較寬且為明顯的前沿峰；BEH C18色譜峰形尖銳，無(wú)拖尾，并和雜質(zhì)峰有較好的分離。采用梯度洗脫程序，進(jìn)一步考察對(duì)比了甲醇水、乙腈水、甲醇-0.1%氨水和乙腈-0.1%氨水4種不同流動(dòng)相的分離情況。結(jié)果表明，甲醇水和乙腈水作為流動(dòng)相時(shí)，丁香酚峰型差，靈敏度較低。而甲醇-0.1%氨水和乙腈-0.1%氨水作為流動(dòng)相時(shí)，由于氨水的存在使丁香酚更易失去氫離子(H+)，離子化效率提高，靈敏度高。且相比之下，乙腈-0.1%氨水的靈敏度最高，和雜質(zhì)分離效果最好，峰型最好。故本研究確定以乙腈-0.1%氨水作為流動(dòng)相。

2.2 方法的線性、檢出限和定量限

在1.0～100.0 μg/L線性范圍內(nèi)，丁香酚在羅非魚(yú)血漿中的線性方程及相關(guān)系數(shù)為Y=1 467X-272(r=0.998 5)；以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得該方法檢出限為0.60 μg/L，以10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算得該方法的定量限為2.0 μg/L。在1.0～90.0 μg/kg線性范圍內(nèi)，丁香酚在羅非魚(yú)肌肉中的線性方程及相關(guān)系數(shù)為Y=0.015 4X-0.002 5(r=0.999 8)；以S/N=3計(jì)算得該方法檢出限為0.65 μg/kg，以S/N=10計(jì)算得該方法的定量限為2.0 μg/kg。

2.3 方法的回收率和精密度

羅非魚(yú)血漿3個(gè)添加水平(2.0、4.0和20.0 μg/L)的平均回收率為97.0%～98.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.14%～2.21%；肌肉3個(gè)添加水平(2.0、4.0和20.0 μg/kg)的平均回收率為90.2%～95.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.91%～5.28%(表2)。

表2 羅非魚(yú)血漿和肌肉中丁香酚的回收率及精密度Tab.2 Recoveries and precision of the eugenol in muscle and plasma of tilapia n=6

3 討論

關(guān)于羅非魚(yú)血漿中丁香酚殘留的檢測(cè)，目前見(jiàn)報(bào)道的多為高效液相色譜法[16]測(cè)定，暫未見(jiàn)采用UPLC-MS/MS的檢測(cè)方法。孫宇航等[16]經(jīng)乙酸乙酯、氨水和無(wú)水硫酸鈉提取，采用正己烷凈化的方法，建立了羅非魚(yú)血漿中丁香酚殘留檢測(cè)的高效液相色譜法，其方法檢出限為5.0 μg/kg。本研究建立了UPLC-MS/MS檢測(cè)羅非魚(yú)血漿中丁香酚殘留的方法，采用甲醇提取，高速離心后即可直接上機(jī)檢測(cè)，與HPLC法相比，其前處理方法簡(jiǎn)單，靈敏度、準(zhǔn)確度均較高。

目前已有學(xué)者采用UPLC-MS/MS測(cè)定水產(chǎn)品肌肉中丁香酚殘留的研究，如趙東豪等[9]采用正己烷提取，經(jīng)UPLC-MS/MS測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量的方法對(duì)魚(yú)類肌肉中丁香酚的殘留進(jìn)行檢測(cè)，定量限為2.5 μg/kg。孫鵬等[18]針對(duì)河蟹、對(duì)蝦和鯉建立了漂浮固化分散液-液微萃取結(jié)合UPLC-MS/MS的方法測(cè)定丁香酚，定量限為4.91 μg/kg。倪崢飛等[19]建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析法，測(cè)定鯽、對(duì)蝦中4種丁香酚類麻醉劑殘留量，以外標(biāo)法定量，結(jié)果表明，丁香酚定量限為2.5 μg/kg。而目前未見(jiàn)采用UPLC-MS/MS測(cè)定羅非魚(yú)肌肉中丁香酚殘留的研究報(bào)道。

在羅非魚(yú)肌肉中丁香酚的檢測(cè)研究方面，陳煥等[12,17,21]采用高效液相色譜法測(cè)定了羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦及鰻鱺中丁香酚類麻醉劑的殘留量，其定量限為50 μg/kg；采用GC-MS法同時(shí)測(cè)定羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦及扇貝中6中丁香酚類麻醉劑的殘留量，方法的定量限為1.0 μg/kg；采用分散固相萃取-氣相色譜法同時(shí)測(cè)定羅非魚(yú)、南美白對(duì)蝦、鰻鱺以及梭子蟹肌肉中6種丁香酚類麻醉劑的殘留量，方法的定量限為100 μg/kg。高平等[13]采用固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定了包括羅非魚(yú)在內(nèi)的水產(chǎn)品中4種丁香酚類化合物，方法檢出限為3.0～6.0 μg/kg。黃武等[14]采用乙腈為提取溶劑，經(jīng)超聲提取、正己烷脫脂凈化2次后，通過(guò)高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)，外標(biāo)法定量，建立了羅非魚(yú)中丁香酚殘留量的高效液相色譜分析方法，其的檢出限為0.03 mg/kg。孫宇航等[16]建立了羅非魚(yú)肌肉中丁香酚殘留檢測(cè)的高效液相色譜法，其方法檢出限為 5.0 μg/kg。

本研究中羅非魚(yú)肌肉中丁香酚殘留檢測(cè)方法與趙東豪等[9]的方法相似，均采用電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)測(cè)定，且均是以子離子m/z163>148作為定量離子，以m/z163>121作為第一定性離子，以m/z166>148作為丁香酚-D3內(nèi)標(biāo)離子峰。與趙東豪等[9]方法的不同之處在于樣品處理方法：本研究中，在采用正己烷提取的基礎(chǔ)上，增加了HLB固相萃取柱凈化過(guò)程，更有效地將分析物與干擾組分分離；且在上HLB柱之前，再次離心樣品，防止出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，提高了分析物的回收率；流動(dòng)相改用乙腈-0.1%氨水，氨水使丁香酚更易失去H+，可提高樣品離子化效率及靈敏度。結(jié)果表明，本研究所建立的羅非魚(yú)肌肉丁香酚UPLC-MS/MS方法定量限可達(dá)2.0 μg/kg，較此前研究靈敏度略有提高。

本研究同時(shí)開(kāi)展羅非魚(yú)血漿和肌肉中丁香酚殘留的研究，其中血漿前處理方法簡(jiǎn)單，肌肉前處理較為繁瑣，在日常的監(jiān)督檢測(cè)中，建議取血漿抽檢，更加方便快捷，大大提高檢測(cè)效率。

4 結(jié)論

本研究建立了一種使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)羅非魚(yú)血漿和肌肉中丁香酚殘留的方法，血漿和肌肉中丁香酚的定量限分別為2.0 μg/L和2.0 μg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好的特點(diǎn)，能夠滿足羅非魚(yú)血漿和肌肉中丁香酚的檢測(cè)要求，可為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法的制訂提供參考依據(jù)，為丁香酚在羅非魚(yú)體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供技術(shù)支持，為豐富和完善丁香酚在羅非魚(yú)體內(nèi)的使用方法和休藥期的制訂提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為其他魚(yú)類血漿中丁香酚殘留檢測(cè)提供方法參考。