陳 萍 陳文娜

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院 (遼寧 沈陽(yáng) 110032);2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院(遼寧 沈陽(yáng) 110032)

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦腎等多種血管相關(guān)性疾病的主要病理基礎(chǔ)，近年來(lái)，隨著人類生活方式的改變和生活水平的改善，其發(fā)病逐漸呈現(xiàn)年輕化，發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[1]。目前研究認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病主要是由于長(zhǎng)期的高脂飲食，加之運(yùn)動(dòng)減少，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，低密度脂蛋白、膽固醇等異常沉積于血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂，血管內(nèi)斑塊形成，管壁增厚，彈性降低而發(fā)展成為動(dòng)脈粥樣硬化[2]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，血管內(nèi)皮沉積導(dǎo)致的炎癥損傷在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，而巨噬細(xì)胞為體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，巨噬細(xì)胞主要存在兩種亞型，即經(jīng)典激活的M1型巨噬細(xì)胞和替代性激活的M2型巨噬細(xì)胞，研究表明，不穩(wěn)定斑塊組織中主要以M1 型巨噬細(xì)胞為主，而穩(wěn)定斑塊組織中M2 型巨噬細(xì)胞比例增加，M1 與M2 型巨噬細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡中[3]。因此，我們認(rèn)為調(diào)控巨噬細(xì)胞適度的分化不僅可以減輕M1型巨噬細(xì)胞造成的血管損傷，同時(shí)亦可增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞的抗炎反應(yīng)，有助于血管的修復(fù)。丹參酮ⅡA是活血祛瘀中藥丹參的主要有效成分，具有抗氧化、抗凋亡等藥理學(xué)作用，被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[4-5]。本研究從巨噬細(xì)胞極化為切入點(diǎn)，深入探討丹參酮ⅡA抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ApoE-/-小鼠20只，相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠10只，8周齡，購(gòu)自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于我校SPF級(jí)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑與儀器 丹參酮ⅡA磺酸鈉購(gòu)于上海第一生化藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H31022558，生產(chǎn)批號(hào)1411105)，TG、TC、LDL、HDL檢測(cè)試劑盒購(gòu)于四川邁克生物科技有限公司。

1.3動(dòng)物分組、造模及干預(yù) 20只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組和丹參酮ⅡA干預(yù)組(簡(jiǎn)稱“干預(yù)組”)，均給予高脂飼料喂養(yǎng)，復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化模型；10只C57BL/6J作為對(duì)照組，予普通小鼠維持飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后，干預(yù)組予腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉，10 mg·kg-1·d-1，模型組和空白組給予等量生理鹽水腹腔注射。12周后，0.5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，心臟穿刺收集血液并分離血清，分離小鼠腹主動(dòng)脈至主動(dòng)脈，分別固定于4%多聚甲醛和凍存于-80 ℃超低溫冰箱中待測(cè)。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 血脂水平檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀分析各種小鼠血清血脂水平變化。

1.4.2 主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 分別采用HE染色法觀察各組小鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化。將4%多聚甲醛溶液中固定的主動(dòng)脈組織取出進(jìn)行包埋切片，切片厚度為5μm，烘片后進(jìn)行脫蠟、復(fù)水，蘇木素-伊紅染色，最后使用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化，并采集圖像。

1.4.3 Western Blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白磷酸化水平變化 采用Western Blot法檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈NF-κB、STAT1、STAT6蛋白水平變化。取小鼠主動(dòng)脈20mg，采用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，loading Buffer與提取后的蛋白裂解液混合后，100℃金屬液加熱5分鐘。采用SDS-PAGE凝膠電泳法分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1h后，一抗孵育，4℃過(guò)夜，次日回收一抗，TBST洗膜3次，每次5～10分鐘，室溫下二抗孵育1h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5～10分鐘，洗膜后采用ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光，化學(xué)法學(xué)發(fā)光儀下進(jìn)行曝光并拍攝圖像。

1.4.4 RT-PCR法檢測(cè)相關(guān)mRNA水平變化 采用RT-PCR檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈TNF-α、IL-6、TGF-β1和IL-10 mRNA表達(dá)水平。取50mg主動(dòng)脈組織液氮低溫研磨后加入1 mL Trizol，加入氯仿μL，離心后，取上層水相，加入等量異丙醇沉淀RNA，離心，加入75%乙醇洗滌，離心，風(fēng)干后加入無(wú)RNA 酶水溶解。紫外吸收測(cè)定法測(cè)定RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板，采用SYBR Green 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，反應(yīng)參數(shù)為95℃ 30s，1個(gè)循環(huán);95℃ 5s，55℃10 s，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，采用△△Ct法計(jì)算各組表達(dá)差異。全部引物有大連Taraka生物科技有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

注：F,forward;R,reverse

2 結(jié)果

2.1各組小鼠血脂水平變化情況 血脂水平檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清TG、TC和LDL水平明顯升高(P<0.01 或P<0.05)，血清HDL水平降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與模型組比較，丹參酮干預(yù)組小鼠血清TG、TC、LDL水平降低(P<0.01或P<0.05)。

圖1 注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2各組小鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)有明顯斑塊形成；與模型組比較，丹參酮ⅡA干預(yù)組主動(dòng)脈內(nèi)斑塊明顯減小。

圖2

2.3各組小鼠主動(dòng)脈蛋白水平變化 Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈與M1極化相關(guān)的信號(hào)通路NF-κB、STAT1磷酸化水平明顯升高(P<0.05)，與M2極化相關(guān)的信號(hào)通路STAT6磷酸化水平降低(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈NF-κB、STAT1磷酸化水平降低(P<0.05)，STAT6磷酸化水平明顯升高(P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠主動(dòng)脈蛋白表達(dá)情況 注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4各組小鼠主動(dòng)脈mRNA水平變化 qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈與M1型細(xì)胞活化相關(guān)的基因(促炎因子)TNF-α、IL-6 mRNA水平升高(P<0.05)，而與M2型細(xì)胞活化相關(guān)的基因(抗炎因子)TGF-β、IL-10 mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈TNF-α、IL-6 mRNA水平降低(P<0.05)，TGF-β、IL-10 mRNA水平升高(P<0.05),見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠主動(dòng)脈基因mRNA表達(dá)情況 注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥引發(fā)的疾病，最終導(dǎo)致動(dòng)脈壁增厚及斑塊形成，是誘發(fā)心肌梗塞及中風(fēng)等心血管疾病的主要因素。目前研究認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生為一個(gè)慢性的炎癥反應(yīng)過(guò)程，主要為脂質(zhì)沉積于血管內(nèi)膜，導(dǎo)致單核細(xì)胞募集并被刺激分化為巨噬細(xì)胞吞噬脂滴形成泡沫細(xì)胞逐漸發(fā)展成為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[6-7]。巨噬細(xì)胞的分型是根據(jù)其極化后所發(fā)揮的功能進(jìn)行命名的，即以分泌促炎因子為主、發(fā)揮促炎活性的為M1型巨噬細(xì)胞；分泌抗炎因子、發(fā)揮抗炎及組織修復(fù)作用的細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞[8-9].既往研究發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定斑塊組織中主要以M1 型巨噬細(xì)胞為主，而穩(wěn)定斑塊組織中M2 型巨噬細(xì)胞比例增加，M1 與M2 型巨噬細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡[10]。M1型巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生大量一氧化氮(NO)、活性氧等中間產(chǎn)物，在血管內(nèi)皮損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而M2型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生大量IL-10及少量IL-12，參與組織重塑、血管發(fā)生和腫瘤發(fā)展等過(guò)程，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞的活化能有效減輕M1 型巨噬細(xì)胞引發(fā)的血管免疫損傷，對(duì)于炎癥反應(yīng)后期的組織損傷具有修復(fù)和重塑作用[11-12]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化為本虛標(biāo)實(shí)之證，氣虛血虧，脾虛痰濕不化，內(nèi)生痰濁、血瘀，加之感受外邪、飲食失調(diào)、情志不暢等因素為誘因?qū)е卤静〉陌l(fā)生，認(rèn)為心主血脈功能失司，血脈失于濡養(yǎng)，氣血運(yùn)行不暢，加之肥甘厚味，脾虛痰濁內(nèi)生，瘀血阻滯，痰瘀互結(jié)，而導(dǎo)致本病發(fā)生的主要病機(jī)[13-14]。中醫(yī)學(xué)對(duì)于本病的治療多采用活血化瘀法進(jìn)行干預(yù)[15]，中藥丹參是治療心血管疾病常用的中藥，臨床療效確切，課題組既往研究發(fā)現(xiàn)中藥丹參的有效成分丹參酮II A能夠有效改善動(dòng)脈粥樣硬化硬化小鼠血脂水平及主動(dòng)脈斑塊形成情況，但其具體機(jī)制尚不明確，本次研究以巨噬細(xì)胞極化在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及炎癥反應(yīng)為切入點(diǎn)，深入探討丹參酮II A抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照比較，模型組小鼠血清TG、TC和LDL水平明顯升高，主動(dòng)脈內(nèi)有明顯斑塊形成，巨噬細(xì)胞分泌的促炎因子水平明顯升高，而經(jīng)丹參酮II A干預(yù)后，與模型組比較，干預(yù)組小鼠血清TG、TC、LDL水平明顯降低，主動(dòng)脈內(nèi)斑塊明顯減小，巨噬細(xì)胞分泌的促炎因子水平明顯減低，抗炎因子水平明顯升高。研究結(jié)果表明，丹參酮ⅡA可有效誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞從M1型向M2型極化的過(guò)渡，降低斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)p-STAT1/NF-κB信號(hào)通路可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化，而丹參酮ⅡA可有效激活p-STAT6磷酸化，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，從而降低炎癥反應(yīng)，提高動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。