張文學(xué) 印邁 續(xù)晨 賁愛玲 蔡小寧

摘? 要：以美國薄殼山核桃嫩莖為外植體，研究了硝態(tài)氮和不同外源激素組合對(duì)其芽誘導(dǎo)和生長的影響。結(jié)果表明，硝態(tài)氮為美國薄殼山核桃組織培養(yǎng)所必需的，較高含量的細(xì)胞分裂素有利于芽的誘導(dǎo)和生長，硝態(tài)氮和細(xì)胞分裂素BA可增加愈傷組織的數(shù)量;適合的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2 B5+NAA 0.1mg/L+BA 2.0mg/L。

關(guān)鍵詞：美國山核桃;組織培養(yǎng);基本培養(yǎng)基;硝態(tài)氮

中圖分類號(hào)? S79文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）11-0022-2

美國山核桃（Carya illinoensis），又名薄殼山核桃、美國薄殼山核桃、碧根果，其果實(shí)是一種老少咸宜的堅(jiān)果食品，深受消費(fèi)者的歡迎;因其木質(zhì)堅(jiān)硬，在家具制作和軍工等方面也有一定的應(yīng)用。開展組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，可以加快繁殖，更快地推廣應(yīng)用，同時(shí)也可以為育種研究提供新的途徑。當(dāng)前，國內(nèi)外有一些對(duì)美國山核桃組織培養(yǎng)的報(bào)道[1-4]，但仍然存在諸多問題，需要從更多方面開展研究。為此，筆者開展了基本培養(yǎng)基的硝態(tài)氮和外源生長素、細(xì)胞分裂素組合對(duì)美國薄殼山核桃芽的誘導(dǎo)和生長的影響研究。

1 材料與方法

1.1 材料 美國薄殼山核桃嫩莖。

1.2 培育種子苗 選取大小相對(duì)一致的碧根果種子，用37℃自來水浸泡7d左右。待種殼裂開移至沙盆，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，在較濕潤的條件下培養(yǎng)14d左右，待裂口處伸出白色小芽，然后在裝有田間土壤的花盆里播種，3～4d左右小芽出土。

1.3 消毒滅菌 從野外大樹上摘取嫩枝，修剪至適當(dāng)大小后放進(jìn)燒杯，在自來水下沖洗干凈，備用。消毒時(shí)先用70%的酒精浸泡20s，倒掉酒精，立即加入滅菌劑。共設(shè)置4個(gè)處理，分別為：0.1%升汞滅菌5min;0.1%升汞滅菌10min;0.1%升汞滅菌15min;84消毒液滅菌10min。滅菌時(shí)間到了后，倒掉滅菌劑，用無菌水沖洗4次，接種于改良WPM添加BA0.5mg/L的培養(yǎng)基上，置25℃，光照時(shí)間12h，黑暗時(shí)間12h周期下培養(yǎng)。7d后統(tǒng)計(jì)外植體污染發(fā)生的情況，并將未受動(dòng)污染的外植體轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上，14d后觀察嫩枝外植體存活的情況。

1.4 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基成分為改良WPM、1/2B5和增減硝態(tài)氮，添加不同數(shù)量的生長素和細(xì)胞分裂素。以上培養(yǎng)基均添加30g/L的蔗糖，用5.6g/L的瓊脂粉固化培養(yǎng)基，在滅菌前調(diào)整pH至5.9左右，培養(yǎng)基配好后在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，121℃保持20min。

1.5 培養(yǎng)室培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度25℃，光照時(shí)間12h，黑暗時(shí)間12h，如此光暗交替輪換。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)外植體滅菌效果的影響 從表1可知，0.1%升汞滅菌效果好于84消毒液;用0.1%升汞滅菌，隨著浸泡外植體的時(shí)間加長，滅菌效果越來越好。0.1%升汞滅菌15min的處理雖然滅菌效果最好，但是對(duì)薄殼山核桃嫩枝的傷害也最大;既能有較好的滅菌效果，傷害也較小的處理為0.1%升汞滅菌10min。另外，也可以看出，取自野外大樹上的嫩枝外植體帶菌嚴(yán)重，公認(rèn)最強(qiáng)的滅菌劑升汞的滅菌效果也難以達(dá)到理想狀態(tài)?？紤]到野外獲取的薄殼山核桃外植體帶菌現(xiàn)象嚴(yán)重，后面的試驗(yàn)從種子直接萌發(fā)長大成幼苗，再剪取幼芽，用作組織培養(yǎng)的外植體材料。

2.2 硝態(tài)氮和不同外源激素組合對(duì)芽誘導(dǎo)和生長的影響 設(shè)計(jì)了4種不同的培養(yǎng)基配方，1號(hào)培養(yǎng)基為1/2B5基本成分+NAA0.1mg/L+BA2.0mg/L;2號(hào)培養(yǎng)基為1/2B5基本成分減去硝酸鉀+NAA0.1mg/L+BA2.0mg/L;3號(hào)培養(yǎng)基為1/2B5基本成分+NAA0.1mg/L;4號(hào)培養(yǎng)基為1/2B5基本成分減去硝酸鉀+NAA0.1mg/L。上述培養(yǎng)基中都添加了30g/L的蔗糖，用5.6g/L的瓊脂粉固化培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基滅菌前調(diào)整pH為5.8～6.0。從表2可見，芽誘導(dǎo)率最高的是1號(hào)培養(yǎng)基，達(dá)到100%，其他幾種配方差不多。比較1號(hào)和2號(hào)培養(yǎng)基配方可知，硝酸鉀對(duì)于芽的誘導(dǎo)是有利的，去除以后，芽的誘導(dǎo)率明顯下降。在只添加低濃度的萘乙酸時(shí)，是否去除硝酸鉀對(duì)芽的誘導(dǎo)率影響不大。

從表3可知，薄殼山核桃組培苗的生長需要在培養(yǎng)基中加入一定的細(xì)胞分裂素，而且硝態(tài)氮也不應(yīng)缺少。添加BA2.0mg/L同時(shí)再添加NAA0.1mg/L，其試管苗的高度優(yōu)于只添加NAA0.1mg/L的處理，褐化率明顯減輕;添加硝酸鉀的處理，其試管苗的高度優(yōu)于減掉硝酸鉀的處理，且褐化率明顯減輕。此外，產(chǎn)生愈傷組織的多少跟是否添加細(xì)胞分裂素和是否減去硝酸鉀有關(guān)，添加細(xì)胞分裂素BA的處理，產(chǎn)生的愈傷組織較多;減去硝酸鉀的處理愈傷組織較少。

3 討論

其他研究者在美國薄殼山核桃的組織培養(yǎng)中曾經(jīng)選用MS、WPM、DKW基本培養(yǎng)基[1-5]，未見采用B5基本培養(yǎng)基的文獻(xiàn)報(bào)道。由本次研究結(jié)果表明，1/2 B5基本培養(yǎng)基也可以用于美國薄殼山核桃的組織培養(yǎng)。

在前期的試驗(yàn)中，筆者采用MS基本培養(yǎng)基添加不同組合的激素，效果不佳，后改用改良WPM培養(yǎng)基取得了一定進(jìn)展?？紤]到MS基本培養(yǎng)基具有較高含量的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，可能是試驗(yàn)結(jié)果不佳的原因，因而又進(jìn)一步嘗試了1/2 B5基本培養(yǎng)基，此基本培養(yǎng)基的特點(diǎn)是含有很低量的銨態(tài)氮和比MS基本培養(yǎng)基適當(dāng)降低含量的硝態(tài)氮。實(shí)驗(yàn)證明，將1/2B5基本培養(yǎng)基中硝態(tài)氮去除，明顯不利于芽的誘導(dǎo)和愈傷組織生長。如果將銨態(tài)氮去除會(huì)發(fā)生什么情況，今后有待于進(jìn)一步研究。

此外，培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素含量與生長素含量比例也很重要，較高比例的細(xì)胞分裂素含量顯然有利于美國山核桃芽的誘導(dǎo)和生長。在另外的試驗(yàn)中，我們?cè)?jīng)將NAA含量由0.1mg/L提高到0.5mg/L，BA含量維持在2.0mg/L，結(jié)果繼代培養(yǎng)的試管苗均褐化死亡，說明NAA含量不宜過高，或許NAA含量可以更低甚至為0，這有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

[1]董筱昀，蔣澤平，蔣春，等.薄殼山核桃試管離體培養(yǎng)中不定芽誘導(dǎo)及增殖技術(shù)的研究[J].江蘇林業(yè)科技，2013，40（3）：10-14.

[2]呂運(yùn)舟，董筱昀，蔣澤平，等.不同無性系薄殼山核桃播種苗的組織培養(yǎng)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（1） ：47-49.

[3]呂運(yùn)舟，竇全琴，蔣澤平.薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素[J].江蘇林業(yè)科技，2015，42（5）：29-32.

[4]Mathews H，Wetzstein H Y. A revised protocol for efficient regeneration of somatic embryos and acclimatization of plantlets in pecan （Carya illinoensis） [J].Plant Science，1993，91（1） ：103-108.

[5]紀(jì)小楠.三種山核桃屬植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究[D].長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)，2009.

（責(zé)編：張宏民）