肖月，鄧盼，常開創(chuàng)，馬泉，錢恩芳，5，余建華，程寶文，李彩霞，江麗

（1.廣東中一司法鑒定中心，廣東 深圳 518000；2.株洲市公安局，湖南 株洲 412007；3.昆明市公安局，云南 昆明 650034；4.公安部物證鑒定中心 北京市現(xiàn)場物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心 現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；5.貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；6.昭通市公安局，云南昭通 657000；7.云南警官學(xué)院，云南 昆明 650221）

目前，我國多省市正廣泛開展Y染色體短串聯(lián)重復(fù)（Y-chromosome short tandem repeat，Y-STR）數(shù)據(jù)庫建設(shè)[1-2]，但偏遠(yuǎn)地區(qū)及多民族混居地區(qū)建庫較困難，因此如何利用現(xiàn)場遺留男性犯罪嫌疑人生物檢材的遺傳標(biāo)記來推測其種族、地域來源一直是法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的難點(diǎn)。本研究在對廣西6個(gè)民族12個(gè)Y染色體單核苷酸多態(tài)性（Y-chromosome single nucleotide polymorphism，Y-SNP）位點(diǎn)檢測基礎(chǔ)上，對不同人群同一Y-SNP單倍群下的26個(gè)Y-STR基因座分別進(jìn)行檢測，并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖分析，探索不同民族之間的差異。

1 材料與方法

1.1 樣本及DNA提取

在志愿者知情同意的原則下，采集廣西地區(qū)6個(gè)民族共439份男性靜脈血樣本，其中廣西漢族65名、廣西京族78名、廣西苗族86名、廣西瑤族73名、廣西壯族84名、廣西侗族53名。被采集血樣的人員追溯其3代以上均居住在廣西地區(qū)且是本族人員。采用QIAamp?DNA Blood Midi試劑盒（德國Qiagen公司）進(jìn)行DNA提取，提取方法按照說明書進(jìn)行。DNA用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司）進(jìn)行定量。

1.2 Y-SNP的檢測分析

依據(jù)國際遺傳譜系學(xué)會(huì)（International Society of Genetic Genealogy，ISOGG；https://isogg.org/tree）2017年版的譜系樹及相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]選擇12個(gè)在中國人群中分布頻率較高的Y-SNP位點(diǎn)：C-M130、D-M174、F-M89、G-M201、J-M304、K-M9、N-M231、O-M175、Q-M242、R-M207、O1-F265、O2-CTS10736。各位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和延伸引物通過Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，位點(diǎn)及引物序列信息見表1。采用SNaPshot微測序技術(shù)對12個(gè)Y-SNP位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增及檢測，應(yīng)用Mastercycler?Pro梯度PCR儀（德國Eppendorf公司）進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，采用3130xl基因分析儀（美國AB公司）對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，使用GeneMapperIDv3.2軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分型。

表1 12個(gè)Y-SNP位點(diǎn)及其引物序列信息

1.3 Y-STR的檢測分析

DNATyperTMY26 PCR試劑盒為公安部物證鑒定中心研發(fā)，其中不包含高突變率基因座。對26個(gè)YSTR基因座用Mastercycler?Pro梯度PCR儀進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用3130xl基因分析儀進(jìn)行檢測，使用GeneMapperIDv3.2軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行STR分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各個(gè)單倍型及單倍群頻率。單倍型多樣性（haplotype diversity，HD）計(jì)算公式為：

式中，n為觀察到的單倍型個(gè)數(shù)，Pi為單倍型頻率。根據(jù)Median-joining方法[5]，對樣本分布頻率較高、同一Y-SNP單倍群下的Y-STR單倍型使用Network 5.0（英國Fluxus Technology公司）構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖（多拷貝Y-STR基因座被排除在外），權(quán)重值[6-7]根據(jù)Y-STR基因座突變率[8]及基因多樣性（多樣性計(jì)算所需數(shù)據(jù)來源于文獻(xiàn)[9]）綜合評估[6-8]，突變率越高，基因多樣性越好的基因座權(quán)重值越低（表2）。

表2 Y-STR基因座突變率及6個(gè)民族基因多樣性

2 結(jié) 果

2.1 Y-SNP單倍群頻率分布及Y-STR單倍型分型結(jié)果

根據(jù)ISOGG 2017年版譜系樹命名方法，12個(gè)YSNP位點(diǎn)在6個(gè)民族439名樣本中檢出了C、D、J、N、O1、O2共6個(gè)單倍群，其頻率及頻數(shù)分布結(jié)果見表3。除了廣西瑤族群體在C單倍群高頻分布外，其他民族單倍群主要分布在O1和O2單倍群，D、J、N單倍群也存在少量的分布。其中廣西漢族、廣西京族、廣西壯族、廣西苗族、廣西侗族在O1單倍群高頻分布，廣西漢族、廣西苗族、廣西侗族在O2單倍群分布頻率也較高。

26個(gè)Y-STR基因座在439個(gè)廣西地區(qū)男性中檢出362個(gè)單倍型，單倍型多樣性為0.9966，在廣西漢、京、苗、瑤、壯、侗族單倍型多樣性分別為0.997 6、0.9942、0.9832、0.9339、0.9863、0.9976。

2.2 C、O1、O2單倍群下構(gòu)建Y-STR網(wǎng)絡(luò)圖

6個(gè)民族分別在C、O1、O2單倍群分布頻率較高，對不同民族同一Y-SNP單倍群下22個(gè)Y-STR單倍型繪制網(wǎng)絡(luò)圖（DYS385a/b、DYS527a/b未納入），在C單倍群（圖1A）中，廣西瑤族群體有44名，且呈典型的星拓狀結(jié)構(gòu)，廣西壯族、廣西侗族、廣西京族、廣西漢族分布較少，各個(gè)民族相對獨(dú)立聚集一簇。O1單倍群人群（圖1B）分布較廣，廣西壯族、廣西京族、廣西苗族以及廣西漢族群體較多，其中部分廣西京族個(gè)體Y-STR單倍型與廣西壯族聚集一簇且處在網(wǎng)絡(luò)圖邊緣；2名廣西漢族個(gè)體和1名廣西侗族個(gè)體及1名廣西京族個(gè)體共享Y-STR單倍型；1名廣西瑤族個(gè)體與1名廣西壯族個(gè)體共享Y-STR單倍型，但兩個(gè)個(gè)體在DYS527a/b基因座上存在差異，分別為21-26、23-26。O2單倍群（圖1C）在各個(gè)民族均有分布，廣西漢族、廣西瑤族、廣西侗族群體較多，部分廣西苗族和廣西瑤族聚集一簇，廣西壯族、廣西京族分布較少?；贏mpF?STRTMYfilerTMPCR擴(kuò)增試劑盒（美國AB公司）中的15個(gè)Y-STR單倍型構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖（DYS385a/b未納入）（圖1D）時(shí)，其共享單倍型個(gè)體比22個(gè)Y-STR單倍型多且單倍型間的分支較少。

表3 6個(gè)Y-SNP單倍群在廣西6個(gè)民族中的頻率及頻數(shù)分布

圖1 廣西6個(gè)民族基于C、O1、O2單倍群下的Y-STR網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

如何利用現(xiàn)場遺留犯罪嫌疑人生物檢材的遺傳標(biāo)記來推測其種族、地域來源一直是法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的難點(diǎn)和重點(diǎn)。近年來，在漢族聚集的省市，通過對現(xiàn)場遺留男性生物檢材的Y-STR分型檢驗(yàn)進(jìn)行男性家系排查偵破了許多重大現(xiàn)案及積案[10]，而在中原文化影響較小、多民族混居地區(qū)的省份很難建設(shè)Y-STR數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行此類排查。Y染色體非重組區(qū)的Y-SNP突變率低，具有種族特異性[11-12]，如本研究中6個(gè)民族的Y-SNP單倍群主要以O(shè)1、O2和C單倍群為主，其中廣西瑤族的C單倍群頻率最高，而其他群體分別在O1或O2單倍群高頻分布。因此，僅利用現(xiàn)場遺留男性生物檢材的Y-SNP單倍群分型很難區(qū)分其種族來源。Y-SNP單倍群劃分可以揭示群體間的大尺度遺傳差異，對不同人群相同單倍群下的Y-STR單倍型進(jìn)行分析，則可以進(jìn)一步描述群體間的小尺度遺傳結(jié)構(gòu)的差別。

2015年，OLOFSSON等[6]通過對3個(gè)群體15個(gè)Y-STR基因座的網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)不同的群體可聚在不同的分支上。本研究的DNATyperTMY26試劑盒包括了AmpF?STRTMYfilerTMPCR擴(kuò)增試劑盒中的17個(gè)基因座，還增加了9個(gè)（DYS444、DYS447、DYS460、DYS508、DYS522、DYS533、DYS617、DYS527a/b）針對中國人群遺傳特征的Y-STR基因座[13-14]，在439個(gè)廣西地區(qū)男性樣本中共檢出362個(gè)單倍型，HD為0.9966。對同一Y-SNP單倍群下不同人群22個(gè)Y-STR單倍型繪制的網(wǎng)絡(luò)圖上，C單倍群中，廣西瑤族、廣西壯族和廣西侗族相對獨(dú)立并分別聚集在不同簇上，能較好地對不同民族進(jìn)行區(qū)分；O1單倍群中，除部分廣西京族個(gè)體樣本與壯族群體樣本混聚在一起外，廣西壯族、廣西苗族和廣西京族相對獨(dú)立并分別聚集一簇，其中2名廣西漢族個(gè)體和1名廣西侗族個(gè)體、1名廣西京族個(gè)體Y-STR分型相同而聚在一起；O2單倍群各民族聚集特點(diǎn)不明顯，本研究僅發(fā)現(xiàn)部分廣西苗族和廣西瑤族樣本相對聚集一簇，網(wǎng)絡(luò)圖較復(fù)雜，這可能與O2單倍群在東亞人群中頻率分布高且包含亞群較多[4，15-16]、本研究選取的Y-STR基因座及各基因座在網(wǎng)絡(luò)圖中的權(quán)重值等因素有關(guān)。下一步隨著檢測樣本的增加，基于更精細(xì)O2單倍群亞群及更多的YSTR基因座構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖能更好地區(qū)分不同起源的民族。如本研究中O2單倍群下基于15個(gè)Y-STR單倍型構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖時(shí)，其共享單倍型個(gè)體比22個(gè)Y-STR單倍型多且單倍型間的分支較少，增加基因座后，網(wǎng)絡(luò)圖能更好地區(qū)分不同族群。

在常規(guī)Y-STR基因座檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過12個(gè)Y-SNP復(fù)合體系檢測并對C、O1和O2單倍群下YSTR數(shù)據(jù)進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)圖分析，C、O1單倍群能初步對不同民族進(jìn)行區(qū)分，為此類地區(qū)利用犯罪現(xiàn)場遺留男性生物檢材的檢驗(yàn)推斷其族群來源，進(jìn)而為案件的偵破提供方向。