季恩成，周也立，陳成帷，陳春，李井，高偉陽(yáng)，潘哲爾

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 手外科，浙江 溫州 325027）

骨關(guān)節(jié)炎是以軟骨的退變、軟骨下骨硬化和滑膜炎癥為特征的全球性疾病，并且最終誘發(fā)關(guān)節(jié)功能障礙[1]。如何有效延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，已成為該領(lǐng)域的一項(xiàng)亟待解決的難題。因此，很有必要探索一種有效的治療骨關(guān)節(jié)炎的方法。法舒地爾是一種Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶（Rho associated coiledcoil forming protein kinase，ROCK）的新型抑制劑，最初被用于蛛網(wǎng)膜下腔出血患者，以緩解血管痙攣并改善其預(yù)后[2]。大量研究報(bào)道了其更為廣泛的效應(yīng)，例如抑制MAPK通路激活的作用[3]。雖然既往研究表明法舒地爾能有效對(duì)抗骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的疼痛，但關(guān)于法舒地爾在該領(lǐng)域的應(yīng)用或分子機(jī)制的研究卻很少。因此，本研究旨在觀察法舒地爾對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的清潔級(jí)1周齡雄性SD大鼠，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。法舒地爾購(gòu)于大連美侖公司；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購(gòu)于北京索來(lái)寶公司；重組IL-1β購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）購(gòu)于日本Dojindo公司；COX-2、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38和GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司；iNOS抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP、Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）二抗和RIPA裂解緩沖液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；One Step TB Green Prime-Script RT-PCR Kit II購(gòu)于美國(guó)Perfect Real Time公司；RNAiso Plus購(gòu)于日本TaKaRa公司；F12/DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；前列腺素E2（PGE2）測(cè)定試劑盒和一氧化氮（NO）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 大鼠軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)：將切下的軟骨切成約0.4 mm大小，于含1%雙抗PBS液沖洗3次，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入0.2% II型膠原酶在37 ℃溫箱消化6 h，加入培養(yǎng)基終止消化，以200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，1 200 r/min離心 5 min，棄上清，將軟骨細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在保持5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%的皿底面積時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集細(xì)胞。然后，將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到10 cm培養(yǎng)皿中。第3代的軟骨細(xì)胞將用于所有實(shí)驗(yàn)。將軟骨細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并且每隔1 d更換培養(yǎng)基。

1.2.2 分組：CCK-8分組方法為：軟骨細(xì)胞分別 加入0、1、2.5、5、10、20、50 μmol/L濃度的法舒地爾溶液，作用24 h后加入CCK-8并檢測(cè)細(xì)胞活性。其余的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組方法為：軟骨細(xì)胞加入終濃度分別為0和10 ng/mL的IL-1β處理24 h后，再分別用終濃度為0與10 μmol/L的法舒地爾處理2 h。分為空白組、法舒地爾組（10 μmol/L）、IL-1β組（10 ng/mL）和IL-1β（10 ng/mL）+法舒地爾 （10 μmol/L）組。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)：根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用CCK-8試劑盒測(cè)定法舒地爾對(duì)軟骨細(xì)胞活性影響。將大鼠軟骨細(xì)胞接種到96孔板上，用遞增濃度的法舒地爾（1、 2.5、5、10、20、50 μmol/L）培養(yǎng)細(xì)胞24或48 h，然后向每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8，并將96孔板在37 ℃下孵育4 h。然后使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。將不加法舒地爾的對(duì)照組吸光度設(shè)為100%，其余各孔的吸光度則換算為對(duì)應(yīng)的百分比。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)：使用RNAiso Plus分離總RNA。在以下反應(yīng)條件下進(jìn)行qRT-PCR：42 ℃下5 min， 95 ℃下10 s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s。在總體積10 μL中進(jìn)行反應(yīng)，其中含有1 μL總RNA，0.4 μL正引物，0.4 μL逆引物，5 μL一步SYBR緩沖液，0.4 μL酶混合物和2.8 μL的去離子水。將靶mRNA水平用GAPDH水平進(jìn)行對(duì)照。使用2-ΔΔCT方法分析數(shù)據(jù)[4]。每個(gè)待檢測(cè)指標(biāo)重復(fù)至少3次。靶基因的引物序列分別為：二型膠原（Collagen- II）： 正向引物5’-CTCAAGTCGCTGAACAACCA-3’，反向引物5’-GTCTCCGCTCTTCCACTCTG-3’；MMP-13：正向引物5’-CTGCGGTTCACTTTGAGGA-3’，反向引物5’-TCTTCTATG AGGCGGGGATA-3’；GAPDH：正向引物5’-TGCCACTCAGAA GACTGTGG-3’，反向引物5’-TTCAGCTCTGGGATGACCT-3’。

1.2.5 Western blot檢測(cè)：使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白質(zhì)，再用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品（40 μg）上樣到SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2 h，將PVDF膜與相應(yīng)的的一抗稀釋液置于4 ℃過(guò)夜。然后與相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。加入ECL顯影液，于化學(xué)發(fā)光儀上曝光分析。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)：將軟骨細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種在6孔板中，孵育24 h。將細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定15 min，并在含有0.5% TritonX-100的PBS中通透15 min。在室溫下用5%山羊血清孵育細(xì)胞1 h，并與MMP-13（1:200）抗體在 4 ℃溫育過(guò)夜。第2天用PBS洗滌后，將細(xì)胞與熒光素綴合的山羊抗兔IgG抗體（1:250）一起孵育1 h，然后用DAPI標(biāo)記5 min，使用熒光顯微鏡捕獲圖像。

1.2.7 NO和PGE2檢測(cè)：細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后收集并離心，得到細(xì)胞上清液。用硝酸還原酶法測(cè)定NO表達(dá)量[5]；上清液中PGE2的表達(dá)量則用ELISA測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SSPS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用s表示。多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 法舒地爾對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活力的影響 與 0 μmol/L法舒地爾比，20、50 μmol/L均能抑制軟骨細(xì)胞增殖，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。因此隨后的實(shí)驗(yàn)將選擇濃度為10 μmol/L的法舒地爾作為相應(yīng)的刺激濃度。

2.2 法舒地爾對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞p-MYPT、ROCK1和ROCK2表達(dá)的影響 與IL-1β組相比，IL-1β+法舒地爾組中ROCK1、ROCK2和p-MYPT蛋白的表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 法舒地爾對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞iNOS、COX-2、NO和PGE2表達(dá)的影響 與空白組比，IL-1β組中iNOS、COX-2、NO和PGE2的表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與IL-1β組比，IL-1β+法舒地爾組中iNOS、COX-2、NO和PGE2有顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 法舒地爾對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞MMP-13和Collagen- II 表達(dá)的影響 與空白組比，IL-1β組中MMP-13的表達(dá)顯著增加，而Collagen- II的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與IL-1β組比，IL-1β+法舒地爾組中MMP-13表達(dá)降低，而Collagen- II的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

2.5 法舒地爾對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞MAPK通路活化的影響 與空白組比，IL-1β組中p-ERK、p-JNK和p-p38的表達(dá)量提高，ERK、JNK與P38的磷酸化水平提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與IL-1β組比，IL-1β+法舒地爾組中p-ERK、p-JNK和p-p38的表達(dá)量降低，ERK、JNK和p38水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖1 不同濃度法舒地爾對(duì)軟骨細(xì)胞活力的影響

圖2 法舒地爾對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞ROCK1、ROCK2、p-MYPT蛋白表達(dá)的影響

圖4 法舒地爾對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞MMP-13表達(dá)和Collagen- II的影響

圖5 法舒地爾對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞MAPK通路活化的影響

3 討論

目前，骨關(guān)節(jié)炎的早期治療主要采取姑息性干預(yù)措施，包括運(yùn)動(dòng)減重，關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉等；而當(dāng)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展至中、晚期時(shí)，病情已難以逆轉(zhuǎn)，膝關(guān)節(jié)成形術(shù)、截骨術(shù)等手術(shù)干預(yù)或成為最后的治療手段。因此尋找一種有效的早期干預(yù)靶點(diǎn)，是骨關(guān)節(jié)炎的研究熱點(diǎn)。降低關(guān)節(jié)軟骨ECM降解水平可抑制骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。目前，已有研究提出了法舒地爾通過(guò)抑制關(guān)節(jié)軟骨ECM降解水平來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎[6]，因此本研究為了驗(yàn)證法舒地爾的藥理作用，進(jìn)一步探究了法舒地爾對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)的影響。

在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中，ECM降解起著至關(guān)重要的作用。而Collagen- II作為ECM的重要成分，主要由MMP-13降解消化[7]。IL-1β的刺激與ECM的降解有關(guān)，并誘導(dǎo)iNOS和COX-2的表達(dá)，產(chǎn)生NO和PGE2，使得骨關(guān)節(jié)發(fā)生非細(xì)菌性的炎性改變。并且，NO在骨關(guān)節(jié)炎中誘導(dǎo)MMP表達(dá)并抑制Collagen- II分泌。PGE2在骨關(guān)節(jié)炎中具有重要的致病作用，例如抑制ECM合成，抑制軟骨細(xì)胞增殖等[8]。我們還檢測(cè)了iNOS和COX-2的蛋白質(zhì)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明表明法舒地爾降低了iNOS和COX-2的表達(dá)，降低了NO和PGE2的表達(dá)，也使MMP-13與Collagen- II表達(dá)接近對(duì)照組，這與我們的推測(cè)表現(xiàn)一致。

ROCK1和ROCK2是ROCK的2種亞型，而ROCK激活后，會(huì)磷酸化MYPT，使得p-MYPT的量增加。法舒地爾作為ROCK的抑制劑，可抑制IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中ROCKs和p-MYPT增加。ROCK在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展中得到了激活，是促進(jìn)軟骨ECM降解的重要機(jī)制之一。并且，鑒于ROCK被認(rèn)為是MAPK途徑的上游[9]，我們猜想骨關(guān)節(jié)炎中ROCK的異常激活狀態(tài)使得下游的MAPK通路也被激活，而應(yīng)用ROCK的抑制劑法舒地爾能夠抑制ROCK，并使得下游的MAPK通路的激活狀態(tài)得到抑制，從而減少了ECM的降解。MAPK通路在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中起重要作用，由ERK，JNK和p38組成的MAPK通路的激活參與了MMP表達(dá)和軟骨結(jié)構(gòu)的破壞[10]，它們的磷酸化水平可表明骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的嚴(yán)重程度。應(yīng)用IL-1β刺激誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞，可模擬骨關(guān)節(jié)炎條件下的ERK、JNK和p38的激活與磷酸化。在骨關(guān)節(jié)炎中， MAPK通路也位于iNOS和COX-2的上游，使其表達(dá)得到增加；也有研究指出MAPK通路的抑制可導(dǎo)致MMP-13表達(dá)的下調(diào)。因此，如果要抑制ECM降解，抑制MAPK通路的激活是可行的途徑之一[11]。我們的實(shí)驗(yàn)證明應(yīng)用法舒地爾可抑制MAPK通路，這一點(diǎn)也與以往的文獻(xiàn)結(jié)果呈現(xiàn)一致。

綜上所述，本研究初步證明法舒地爾對(duì)軟骨ECM降解具有抑制作用，并且能下調(diào)促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎性進(jìn)展的炎癥介質(zhì)表達(dá)，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制ROCK，繼而抑制MAPK通路激活來(lái)起效的。本研究提示法舒地爾是一種潛在的治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。