陳永發(fā)，楊文，潘興喜，唐武兵，童麗華，劉敏東，伍楚蓉

南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 佛山5282000

宮頸癌為臨床最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其中宮頸原位癌高發(fā)于30～35歲女性人群，宮頸浸潤(rùn)癌則高發(fā)于45～55歲女性人群[1]。近年來(lái)，宮頸癌的發(fā)病率逐年增高，且呈年輕化趨勢(shì)。隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的應(yīng)用，宮頸癌及癌前病變的早期檢出率及5年生存率均明顯提高[2]。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）可與相應(yīng)的配體結(jié)合形成同源二聚體或異源二聚體而使受體的絡(luò)氨酸激酶啟動(dòng)細(xì)胞增殖、凋亡及新生血管生成等[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)及增加微血管通透性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及新血管生成[4]。Ki-67是一種DNA結(jié)合蛋白，存在于增殖細(xì)胞內(nèi)參與驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可用于辨別正常生長(zhǎng)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)[5]。第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）位于人體第10號(hào)染色體，是一種具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼產(chǎn)物PTEN蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[6]。目前，關(guān)于宮頸癌患者腫瘤組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN表達(dá)情況的研究多集中于上述指標(biāo)表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系，但就上述指標(biāo)與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及與預(yù)后關(guān)系的研究仍較少。本研究對(duì)宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探討，旨在為宮頸癌的臨床診治及預(yù)后預(yù)測(cè)提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012年10月至2016年3月于南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海區(qū)人民醫(yī)院接受治療的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者86例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌；②就診前未接受抗腫瘤治療；③神智清醒，智力正常，與醫(yī)護(hù)人員交流無(wú)障礙；④行廣泛子宮切除術(shù)+淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后視病情按美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南[7]行同期放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；②合并其他惡性腫瘤者；③合并其他婦科疾病者。86例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的年齡為34～75歲，平均年齡為（53.08±2.50）歲；腫瘤直徑 0.5～6.0 cm，平均（2.27±0.68）cm；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期[8]：Ⅰb～Ⅱa期13例，Ⅱb期25例，Ⅲ～Ⅳa期48例；分化程度：高分化34例，中低分化52例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）淋巴結(jié)短徑＞1 cm]54例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。收集86例宮頸鱗癌患者的宮頸癌組織標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有患者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑

鼠抗人EGFR抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人PTEN單克隆抗體均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。通用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）檢驗(yàn)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒均購(gòu)自上海康朗生物科技有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

采用SP法對(duì)宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。取宮頸癌組織，切片行DAB染色，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行固定、血清封閉、孵育、洗滌與DAB染色，分別以鼠抗人EGFR抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人PTEN單克隆抗體作為一抗，以生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，并以SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

由2名具5年以上經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員進(jìn)行閱片，結(jié)果不一致時(shí)由1名10年以上經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員對(duì)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核。EGFR、VEGF、Ki-67及PTEN以細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜10%或未出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞則判定為EGFR、VEGF、Ki-67及PTEN陰性；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為10%～50%判定為弱陽(yáng)性；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為51%～75%判定為中等陽(yáng)性；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＞75%判定為強(qiáng)陽(yáng)性。本研究以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%（弱陽(yáng)性～強(qiáng)陽(yáng)性）為EGFR、VEGF、Ki-67及PTEN陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；Spearman相關(guān)性分析各指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN表達(dá)與宮頸癌患者臨床特征關(guān)系

不同年齡宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.497、0.303、0.644、0.284，P＞0.05）；腫瘤直徑＞4 cm、FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為中低分化宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)率均高于腫瘤直徑≤4 cm、FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為高分化的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2EGFR=7.460、5.611、18.259、3.997，PEGFR＜0.05；χ2VEGF=7.967、5.375、7.484、5.259，PVEGF＜0.05；χ2Ki-67=13.430、6.801、30.401、5.385，PKi-67＜0.05）。腫瘤直徑＞4 cm、FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為中低分化宮頸癌患者宮頸癌組織中PTEN的陽(yáng)性表達(dá)率均低于腫瘤直徑≤4 cm、FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為高分化的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.350、22.324、18.121、7.520，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN的陽(yáng)性表達(dá)情況

2.2 宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.461、0.295、0.595，P＜0.05），PTEN陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（r=-0.459，P＜0.05）。

2.3 宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

EGFR陽(yáng)性表達(dá)宮頸癌患者的生存情況與EGFR陰性表達(dá)患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。VEGF陰性表達(dá)宮頸癌患者的中位生存時(shí)間為 30個(gè)月（95%CI：24.57～35.43個(gè)月），長(zhǎng)于VEGF陽(yáng)性表達(dá)患者的 23個(gè)月（95%CI：20.93～25.07個(gè)月）；VEGF陰性表達(dá)宮頸癌患者的生存情況與VEGF陽(yáng)性表達(dá)患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.450，P＜0.05）（圖2）。Ki-67陰性表達(dá)宮頸癌患者的中位生存時(shí)間為36個(gè)月（95%CI：32.29～39.71個(gè)月），長(zhǎng)于Ki-67陽(yáng)性表達(dá)患者的26個(gè)月（95%CI：23.14～28.86個(gè)月）；Ki-67陰性表達(dá)宮頸癌患者的生存情況與Ki-67陽(yáng)性表達(dá)患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.616，P＜0.05）（圖3）。PTEN陽(yáng)性表達(dá)宮頸癌患者的中位生存時(shí)間為30個(gè)月（95%CI：26.58～33.42個(gè)月），長(zhǎng)于PTEN陰性表達(dá)患者的24個(gè)月（95%CI：16.49～31.51個(gè)月）；PTEN陽(yáng)性表達(dá)宮頸癌患者的生存情況與PTEN陰性表達(dá)患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.436，P＜0.05）（圖4）。

圖1 EGFR陽(yáng)性表達(dá)（ n=61）和EGFR陰性表達(dá)（ n=25）患者的總生存曲線

圖2 VEGF陽(yáng)性表達(dá)（ n=46）和VEGF陰性表達(dá)（ n=40）患者的總生存曲線

圖3 Ki-67陽(yáng)性表達(dá)（ n=58）和Ki-67陰性表達(dá)（ n=28）患者的總生存曲線

圖4 PTEN陽(yáng)性表達(dá)（ n=53）和PTEN陰性表達(dá)（ n=33）患者的總生存曲線

3 討論

宮頸癌為女性惡性腫瘤中第二常見(jiàn)類型，據(jù)調(diào)查全球每年約有78萬(wàn)女性因?qū)m頸癌而死亡，其中80%來(lái)自發(fā)展中國(guó)家[9]。相關(guān)研究表明，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)[9-12]。

EGFR為原癌基因C-erbB-1（HER1）的表達(dá)產(chǎn)物，位于人體染色體7p13-7p12上，為Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體，在與EGFR配體結(jié)合后可以促進(jìn)細(xì)胞增殖而使其出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化[13-14]。相關(guān)研究顯示，EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路位于G-蛋白等多種信號(hào)通道交匯處，其異常表達(dá)與乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），且宮頸癌組織中EGFR陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05）。EGFR主要分布于細(xì)胞膜，為細(xì)胞表面?zhèn)鞲衅?，具有酪氨酸激酶活性。EGFR高表達(dá)不僅可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，還可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤新生血管生成，參與上皮源性惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，因而EGFR高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[16]。但本研究結(jié)果顯示，不同EGFR表達(dá)情況宮頸癌患者的生存情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），究其原因可能與本研究樣本量較小，結(jié)果出現(xiàn)偏倚有關(guān)。

VEGF為內(nèi)皮細(xì)胞的特異性優(yōu)勢(shì)分裂原，在體外可以有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，在體內(nèi)則可以誘導(dǎo)新血管生成。研究顯示，VEGF可以通過(guò)其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移起到促進(jìn)作用，同時(shí)還可阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及宮腔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的退化而增加血管通透性，對(duì)腫瘤血管生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[17]。本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），且宮頸癌組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05），與相關(guān)研究結(jié)果一致[18]，提示VEGF過(guò)表達(dá)患者的惡性程度較高，發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率大，宮頸癌組織中VEGF的水平可以反映局部浸潤(rùn)活性及轉(zhuǎn)移潛能。VEGF可通過(guò)與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性腫瘤標(biāo)志物VEGFR-3介導(dǎo)新生淋巴管的生長(zhǎng)而起到促進(jìn)腫瘤淋巴管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用。但有研究顯示，VEGF的高表達(dá)并不會(huì)增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[19]，可能與VEGF的基因多態(tài)性有關(guān)，VEGF含30個(gè)以上單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，不同位點(diǎn)對(duì)于VEGF的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)均有較大的影響，故本研究結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果不一致。

Ki-67蛋白為貫穿表達(dá)于增殖期細(xì)胞中的核抗原，在維持細(xì)胞增殖活性中有重要的作用，其在細(xì)胞有絲分裂期的G1、S、G2期及M期均有合成，而在G0期卻表達(dá)缺失，可準(zhǔn)確反映出細(xì)胞的增殖活性，該指標(biāo)已被證實(shí)與乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的生活學(xué)行為密切相關(guān)[20]，本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），且宮頸癌組織中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05），與相關(guān)研究結(jié)果相一致[20]。

目前PTEN與宮頸癌患者臨床特征關(guān)系方面的研究尚存在一定的爭(zhēng)議，本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中PTEN的陽(yáng)性表達(dá)率低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），且宮頸癌組織中PTEN的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與郝?tīng)q月[21]的研究結(jié)果基本一致。宮頸癌患者病情加重，PTEN陽(yáng)性表達(dá)率明顯下降，可能與PTEN基因啟動(dòng)子甲基化有關(guān)[22]。PTEN基因位于染色體10q23位點(diǎn)，共包含1209個(gè)編碼核苷酸組成讀碼框架，PTEN蛋白由403個(gè)氨基酸組成，N端為其關(guān)節(jié)功能結(jié)構(gòu)部位，蛋白功能多在此部位完成。PTEN基因可以通過(guò)抑制促分裂素原活化蛋白激酶的磷酸化而阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)其還可抑制蛋白激酶B通路而阻止原癌基因雙微體2的核轉(zhuǎn)位，增加抑癌基因p53的活性并促進(jìn)其增殖而實(shí)現(xiàn)周期阻滯。

綜上所述，宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN的表達(dá)與腫瘤直徑、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可用于患者的預(yù)后預(yù)測(cè)。