陳永發(fā)，楊文，潘興喜，唐武兵，童麗華，劉敏東，伍楚蓉

南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 佛山5282000

宮頸癌為臨床最常見的婦科惡性腫瘤，其中宮頸原位癌高發(fā)于30～35歲女性人群，宮頸浸潤癌則高發(fā)于45～55歲女性人群[1]。近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐年增高，且呈年輕化趨勢。隨著宮頸細胞學(xué)篩查的應(yīng)用，宮頸癌及癌前病變的早期檢出率及5年生存率均明顯提高[2]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）可與相應(yīng)的配體結(jié)合形成同源二聚體或異源二聚體而使受體的絡(luò)氨酸激酶啟動細胞增殖、凋亡及新生血管生成等[3]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以通過刺激血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖，促進內(nèi)皮細胞基因表達及增加微血管通透性，從而促進腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移及新血管生成[4]。Ki-67是一種DNA結(jié)合蛋白，存在于增殖細胞內(nèi)參與驅(qū)動細胞周期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可用于辨別正常生長細胞及腫瘤細胞的增殖狀態(tài)[5]。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）位于人體第10號染色體，是一種具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼產(chǎn)物PTEN蛋白具有調(diào)節(jié)細胞生長、誘導(dǎo)細胞凋亡及抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用[6]。目前，關(guān)于宮頸癌患者腫瘤組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN表達情況的研究多集中于上述指標(biāo)表達與患者臨床特征的關(guān)系，但就上述指標(biāo)與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及與預(yù)后關(guān)系的研究仍較少。本研究對宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN的表達情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系進行探討，旨在為宮頸癌的臨床診治及預(yù)后預(yù)測提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年10月至2016年3月于南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海區(qū)人民醫(yī)院接受治療的宮頸鱗狀細胞癌患者86例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸鱗狀細胞癌；②就診前未接受抗腫瘤治療；③神智清醒，智力正常，與醫(yī)護人員交流無障礙；④行廣泛子宮切除術(shù)+淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后視病情按美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南[7]行同期放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有遠處轉(zhuǎn)移者；②合并其他惡性腫瘤者；③合并其他婦科疾病者。86例宮頸鱗狀細胞癌患者的年齡為34～75歲，平均年齡為（53.08±2.50）歲；腫瘤直徑 0.5～6.0 cm，平均（2.27±0.68）cm；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期[8]：Ⅰb～Ⅱa期13例，Ⅱb期25例，Ⅲ～Ⅳa期48例；分化程度：高分化34例，中低分化52例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[計算機斷層掃描（CT）淋巴結(jié)短徑＞1 cm]54例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。收集86例宮頸鱗癌患者的宮頸癌組織標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

鼠抗人EGFR抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人PTEN單克隆抗體均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。通用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）檢驗試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒均購自上?？道噬锟萍加邢薰?。

1.3 檢測方法

采用SP法對宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN的表達水平進行檢測。取宮頸癌組織，切片行DAB染色，按照試劑盒說明書進行固定、血清封閉、孵育、洗滌與DAB染色，分別以鼠抗人EGFR抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人PTEN單克隆抗體作為一抗，以生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，并以SP法進行免疫組織化學(xué)檢測，以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

由2名具5年以上經(jīng)驗的檢驗人員進行閱片，結(jié)果不一致時由1名10年以上經(jīng)驗的檢驗人員對結(jié)果進行復(fù)核。EGFR、VEGF、Ki-67及PTEN以細胞質(zhì)和（或）細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，陽性細胞所占比例＜10%或未出現(xiàn)陽性細胞則判定為EGFR、VEGF、Ki-67及PTEN陰性；陽性細胞所占比例為10%～50%判定為弱陽性；陽性細胞所占比例為51%～75%判定為中等陽性；陽性細胞所占比例＞75%判定為強陽性。本研究以陽性細胞數(shù)≥10%（弱陽性～強陽性）為EGFR、VEGF、Ki-67及PTEN陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；Spearman相關(guān)性分析各指標(biāo)陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN表達與宮頸癌患者臨床特征關(guān)系

不同年齡宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.497、0.303、0.644、0.284，P＞0.05）；腫瘤直徑＞4 cm、FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為中低分化宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67的陽性表達率均高于腫瘤直徑≤4 cm、FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為高分化的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2EGFR=7.460、5.611、18.259、3.997，PEGFR＜0.05；χ2VEGF=7.967、5.375、7.484、5.259，PVEGF＜0.05；χ2Ki-67=13.430、6.801、30.401、5.385，PKi-67＜0.05）。腫瘤直徑＞4 cm、FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為中低分化宮頸癌患者宮頸癌組織中PTEN的陽性表達率均低于腫瘤直徑≤4 cm、FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為高分化的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.350、22.324、18.121、7.520，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN的陽性表達情況

2.2 宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67陽性表達均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.461、0.295、0.595，P＜0.05），PTEN陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)（r=-0.459，P＜0.05）。

2.3 宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN表達與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

EGFR陽性表達宮頸癌患者的生存情況與EGFR陰性表達患者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。VEGF陰性表達宮頸癌患者的中位生存時間為 30個月（95%CI：24.57～35.43個月），長于VEGF陽性表達患者的 23個月（95%CI：20.93～25.07個月）；VEGF陰性表達宮頸癌患者的生存情況與VEGF陽性表達患者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.450，P＜0.05）（圖2）。Ki-67陰性表達宮頸癌患者的中位生存時間為36個月（95%CI：32.29～39.71個月），長于Ki-67陽性表達患者的26個月（95%CI：23.14～28.86個月）；Ki-67陰性表達宮頸癌患者的生存情況與Ki-67陽性表達患者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.616，P＜0.05）（圖3）。PTEN陽性表達宮頸癌患者的中位生存時間為30個月（95%CI：26.58～33.42個月），長于PTEN陰性表達患者的24個月（95%CI：16.49～31.51個月）；PTEN陽性表達宮頸癌患者的生存情況與PTEN陰性表達患者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.436，P＜0.05）（圖4）。

圖1 EGFR陽性表達（ n=61）和EGFR陰性表達（ n=25）患者的總生存曲線

圖2 VEGF陽性表達（ n=46）和VEGF陰性表達（ n=40）患者的總生存曲線

圖3 Ki-67陽性表達（ n=58）和Ki-67陰性表達（ n=28）患者的總生存曲線

圖4 PTEN陽性表達（ n=53）和PTEN陰性表達（ n=33）患者的總生存曲線

3 討論

宮頸癌為女性惡性腫瘤中第二常見類型，據(jù)調(diào)查全球每年約有78萬女性因?qū)m頸癌而死亡，其中80%來自發(fā)展中國家[9]。相關(guān)研究表明，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)[9-12]。

EGFR為原癌基因C-erbB-1（HER1）的表達產(chǎn)物，位于人體染色體7p13-7p12上，為Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，在與EGFR配體結(jié)合后可以促進細胞增殖而使其出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化[13-14]。相關(guān)研究顯示，EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路位于G-蛋白等多種信號通道交匯處，其異常表達與乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），且宮頸癌組織中EGFR陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05）。EGFR主要分布于細胞膜，為細胞表面?zhèn)鞲衅?，具有酪氨酸激酶活性。EGFR高表達不僅可以促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，還可以通過促進腫瘤新生血管生成，參與上皮源性惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，因而EGFR高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[16]。但本研究結(jié)果顯示，不同EGFR表達情況宮頸癌患者的生存情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），究其原因可能與本研究樣本量較小，結(jié)果出現(xiàn)偏倚有關(guān)。

VEGF為內(nèi)皮細胞的特異性優(yōu)勢分裂原，在體外可以有效促進內(nèi)皮細胞的生長，在體內(nèi)則可以誘導(dǎo)新血管生成。研究顯示，VEGF可以通過其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對內(nèi)皮細胞的增殖、遷移起到促進作用，同時還可阻止內(nèi)皮細胞凋亡及宮腔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的退化而增加血管通透性，對腫瘤血管生長具有促進作用[17]。本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中VEGF的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），且宮頸癌組織中VEGF陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05），與相關(guān)研究結(jié)果一致[18]，提示VEGF過表達患者的惡性程度較高，發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率大，宮頸癌組織中VEGF的水平可以反映局部浸潤活性及轉(zhuǎn)移潛能。VEGF可通過與淋巴管內(nèi)皮細胞特異性腫瘤標(biāo)志物VEGFR-3介導(dǎo)新生淋巴管的生長而起到促進腫瘤淋巴管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用。但有研究顯示，VEGF的高表達并不會增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險[19]，可能與VEGF的基因多態(tài)性有關(guān)，VEGF含30個以上單核苷酸多態(tài)位點，不同位點對于VEGF的轉(zhuǎn)錄及表達均有較大的影響，故本研究結(jié)果與文獻結(jié)果不一致。

Ki-67蛋白為貫穿表達于增殖期細胞中的核抗原，在維持細胞增殖活性中有重要的作用，其在細胞有絲分裂期的G1、S、G2期及M期均有合成，而在G0期卻表達缺失，可準(zhǔn)確反映出細胞的增殖活性，該指標(biāo)已被證實與乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的生活學(xué)行為密切相關(guān)[20]，本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中Ki-67的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），且宮頸癌組織中Ki-67陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05），與相關(guān)研究結(jié)果相一致[20]。

目前PTEN與宮頸癌患者臨床特征關(guān)系方面的研究尚存在一定的爭議，本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中PTEN的陽性表達率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），且宮頸癌組織中PTEN的陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)（P＜0.05），與郝爍月[21]的研究結(jié)果基本一致。宮頸癌患者病情加重，PTEN陽性表達率明顯下降，可能與PTEN基因啟動子甲基化有關(guān)[22]。PTEN基因位于染色體10q23位點，共包含1209個編碼核苷酸組成讀碼框架，PTEN蛋白由403個氨基酸組成，N端為其關(guān)節(jié)功能結(jié)構(gòu)部位，蛋白功能多在此部位完成。PTEN基因可以通過抑制促分裂素原活化蛋白激酶的磷酸化而阻滯細胞生長，同時其還可抑制蛋白激酶B通路而阻止原癌基因雙微體2的核轉(zhuǎn)位，增加抑癌基因p53的活性并促進其增殖而實現(xiàn)周期阻滯。

綜上所述，宮頸癌患者宮頸癌組織中EGFR、VEGF、Ki-67、PTEN的表達與腫瘤直徑、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可用于患者的預(yù)后預(yù)測。