邵淑娟，汪方園，王宏利，杜巍

河北中石油中心醫(yī)院1婦科，2實驗室，河北 廊坊0650000

子宮內膜癌是發(fā)生于子宮內膜的上皮性惡性腫瘤，約占女性生殖系統(tǒng)腫瘤的20%～30%[1]。在中國，子宮內膜癌的發(fā)病率僅次于宮頸癌，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位，嚴重威脅人們的生命健康[2]。近年來，早期子宮內膜癌經過規(guī)范治療后，5年生存率逐年升高，但晚期、低分化子宮內膜癌患者的預后極差，是患者死亡的重要因素[3]。目前，尚不清楚子宮內膜癌發(fā)病的確切機制。正五聚蛋白 3（pentraxin 3，PTX3）是一種長五聚素分子，由381個氨基酸組成，屬于成熟型分泌蛋白，機體炎性反應時其表達水平升高[4]。文獻報道，PTX3在介導體液和抗原免疫應答過程中發(fā)揮著重要的作用[5]，且在人宮頸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌等多種惡性腫瘤中高表達[6-7]，但國內有關PTX3在子宮內膜癌中表達的研究較少，因此，本研究探討了PTX3在子宮內膜癌組織中的表達及臨床意義，以期為了解PTX3在子宮內膜癌中的生物學作用提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年3月至2018年3月于河北中石油中心醫(yī)院診治的78例子宮內膜癌患者。納入標準：①經子宮內膜癌根治術后組織病理學檢查確診為原發(fā)性子宮內膜癌；②初發(fā)病例；③術前未接受放化療。排除標準：①伴急性或慢性感染性疾病；②合并其他惡性腫瘤；③合并血液系統(tǒng)疾病。納入的78例子宮內膜癌患者，年齡為39～72歲，平均年齡為（53.8±9.1）歲；病理類型：子宮內膜樣癌59例，非子宮內膜樣癌19例；臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期29例，Ⅲ期30例，Ⅳ期11例。收集患者的子宮內膜癌組織（1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm）作為檢測樣本，另取癌旁組織（距癌組織邊緣≥5 cm）作為對照組織，且經病理檢查證實為正常子宮內膜組織。采集的組織樣本經焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）溶液清洗后，拭干，立即放入液氮中，再轉入-80℃冰箱保存待用。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，且在研究前已告知患者及其家屬樣本用途并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒、逆轉錄酶試劑盒均購自美國Invitrogen公司，Bulge-Loop miRNA實時熒光聚合酶鏈反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司，蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，PTX3基因引物購自上海生工生物工程股份有限公司，兔抗人PTX3抗體購自美國Cell Signaling公司，ABI7500聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）測定儀、紫外分光光度計均購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 RT-PCR檢測PTX 3mRNA相對表達量 組織總RNA的提?。簩⒔M織樣本進行超聲勻漿，嚴格按照RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA，DEPC溶液溶解，將1 μl RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性；應用紫外分光光度計檢測RNA的純度及濃度。逆轉錄反應：嚴格按照逆轉錄試劑盒操作說明書進行操作，反應體系為20 μl，冰上依次加入以下試劑：總 RNA 1 μl、10×RT buffer 1.5 μl、1 μmol/L的逆轉錄特異性引物 3 μl、50 U/μl的逆轉錄酶 1.0 μl、20 U/μl的 RNA 酶抑制劑0.19 μl、100 mmol/L的脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）0.15 μl，加 DEPC溶液補至 20 μl。反應條件：37℃ 60 min，95℃5 min，產物置于-20℃冰箱中保存。實時熒光定量PCR：嚴格按照PCR試劑盒說明書進行PCR擴增。反應體系為20 μl，冰上依次加入以下試劑：逆轉錄產物 cDNA 1 μl、引物 1 μl、混合物 10 μl，加雙蒸水補至20 μl。反應條件：95℃反應20 s，95℃反應10 s，60℃反應20 s，共40個循環(huán)。結果分析：每組設3個重復，根據△△CT法對結果進行相對定量分析，根據各樣本的平均 Ct值，采用 2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。PTX3mRNA的相對表達量=2-ΔΔCt值（PTX3）-2-ΔΔCt值[甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）]。

1.3.2 蛋白質印記法（Westernblot）檢測PTX 3蛋白的相對表達量 嚴格按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，根據PTX3蛋白相對分子質量，用合適濃度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，并濕轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，加入稀釋一抗，4℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-吐溫20緩沖液（trihydroxymethyl aminomethane hydrochloride buffered solution with Tween 20，TBS-T）洗滌3次，加入二抗，室溫孵育2 h，TBS-T洗滌3次。采集化學發(fā)光圖像，并用Image J軟件對反應條帶進行灰度分析，PTX3蛋白的相對表達量=PTX3灰度值/GAPDH灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數據。計數資料以例數表示；計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PTX 3 mRNA及PTX 3蛋白在子宮內膜癌組織及癌旁正常組織中相對表達量的比較

PTX3mRNA及PTX3蛋白在子宮內膜癌組織中的相對表達量均高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 PTX 3 mRNA及PTX 3蛋白在子宮內膜癌組織及癌旁正常組織中相對表達量的比較（±s）

表1 PTX 3 mRNA及PTX 3蛋白在子宮內膜癌組織及癌旁正常組織中相對表達量的比較（±s）

組織子宮內膜癌組織（n=78）癌旁正常組織（n=78）t值P值PTX3 mRNA相對表達量4.72±0.27 0.98±0.73 50.047 0.000 PTX3蛋白相對表達量1.96±0.34 0.49±0.86 25.456 0.000

2.2 不同基線特征子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中PTX 3 mRNA及PTX 3蛋白相對表達量的比較

臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達量均明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的患者，不同組織分化程度的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而不同年齡、病理類型、腫瘤直徑、肌層浸潤深度的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同基線特征的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中PTX 3 mRNA及PTX 3蛋白的相對表達量

3 討論

子宮內膜癌是常見的婦科惡性腫瘤之一。隨著人們生活方式的改變，子宮內膜癌的發(fā)病率逐年上升且發(fā)病呈低齡化趨勢，嚴重威脅女性的身體健康[8]。雖然早期子宮內膜癌患者經過規(guī)范治療后，5年生存率升高，但晚期、低分化子宮內膜癌患者預后極差，是導致子宮內膜癌患者死亡的重要因素[9]。PTX是一種可溶性模式識別分子，在免疫應答中扮演重要的角色[10]。PTX的特征是環(huán)狀多聚結構，通常呈五聚體，C末端包含由203個氨基酸構成的保守結構域，為正五聚蛋白結構域[11]。PTX3是一種急性期反應蛋白，在介導體液和抗原免疫應答過程中發(fā)揮著重要的作用，參與女性生育、免疫防御、動脈粥樣硬化、細胞凋亡和血管再生等多種生理病理過程[12-14]。研究顯示，當機體因外部不良刺激產生炎性反應時，體內多種炎性細胞如內皮細胞、成纖維細胞、單核巨噬細胞和樹突狀細胞等會產生并釋放PTX3[15-16]。研究發(fā)現，與癌旁組織相比，PTX3在肺腺癌組織中的表達水平明顯升高（P＜0.01），且與淋巴癌轉移的發(fā)生率呈正相關（P＜0.01）[17]。然而，國內尚無研究報道PTX3在子宮內膜癌中的表達及其生物學功能。本研究結果顯示，PTX3mRNA及PTX3蛋白在子宮內膜癌組織中的相對表達量均高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示PTX3表達上調可能與子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展有關。本研究進一步比較了不同基線特征的子宮內膜癌患者子宮內膜組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達量，結果發(fā)現，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達量均明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的患者（P＜0.01）；不同組織分化程度的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而不同年齡、病理類型、腫瘤直徑、肌層浸潤深度的子宮內膜癌患者子宮內膜組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這提示PTX3表達不易受個體因素影響，其對子宮內膜癌的進展、淋巴結轉移情況及組織分化程度的判斷具有一定的臨床價值，可能是子宮內膜癌早期診斷的潛在標志物和治療新靶點。綜上所述，與癌旁正常組織比較，PTX3在子宮內膜癌組織中的相對表達量較高，其可能與子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展有關。但本研究的樣本量較少，今后需擴大樣本量，進一步研究PTX3與子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展的關系，以期為子宮內膜癌的臨床診治提供更有價值的參考依據。