邵淑娟，汪方園，王宏利，杜巍

河北中石油中心醫(yī)院1婦科，2實(shí)驗(yàn)室，河北 廊坊0650000

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，約占女性生殖系統(tǒng)腫瘤的20%～30%[1]。在中國，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率僅次于宮頸癌，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位，嚴(yán)重威脅人們的生命健康[2]。近年來，早期子宮內(nèi)膜癌經(jīng)過規(guī)范治療后，5年生存率逐年升高，但晚期、低分化子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后極差，是患者死亡的重要因素[3]。目前，尚不清楚子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的確切機(jī)制。正五聚蛋白 3（pentraxin 3，PTX3）是一種長五聚素分子，由381個氨基酸組成，屬于成熟型分泌蛋白，機(jī)體炎性反應(yīng)時其表達(dá)水平升高[4]。文獻(xiàn)報道，PTX3在介導(dǎo)體液和抗原免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的作用[5]，且在人宮頸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)[6-7]，但國內(nèi)有關(guān)PTX3在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的研究較少，因此，本研究探討了PTX3在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及臨床意義，以期為了解PTX3在子宮內(nèi)膜癌中的生物學(xué)作用提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年3月至2018年3月于河北中石油中心醫(yī)院診治的78例子宮內(nèi)膜癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)子宮內(nèi)膜癌根治術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性子宮內(nèi)膜癌；②初發(fā)病例；③術(shù)前未接受放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴急性或慢性感染性疾??；②合并其他惡性腫瘤；③合并血液系統(tǒng)疾病。納入的78例子宮內(nèi)膜癌患者，年齡為39～72歲，平均年齡為（53.8±9.1）歲；病理類型：子宮內(nèi)膜樣癌59例，非子宮內(nèi)膜樣癌19例；臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期29例，Ⅲ期30例，Ⅳ期11例。收集患者的子宮內(nèi)膜癌組織（1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm）作為檢測樣本，另取癌旁組織（距癌組織邊緣≥5 cm）作為對照組織，且經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜組織。采集的組織樣本經(jīng)焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）溶液清洗后，拭干，立即放入液氮中，再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且在研究前已告知患者及其家屬樣本用途并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒均購自美國Invitrogen公司，Bulge-Loop miRNA實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司，蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，PTX3基因引物購自上海生工生物工程股份有限公司，兔抗人PTX3抗體購自美國Cell Signaling公司，ABI7500聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）測定儀、紫外分光光度計均購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 RT-PCR檢測PTX 3mRNA相對表達(dá)量 組織總RNA的提取：將組織樣本進(jìn)行超聲勻漿，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA，DEPC溶液溶解，將1 μl RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性；應(yīng)用紫外分光光度計檢測RNA的純度及濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系為20 μl，冰上依次加入以下試劑：總 RNA 1 μl、10×RT buffer 1.5 μl、1 μmol/L的逆轉(zhuǎn)錄特異性引物 3 μl、50 U/μl的逆轉(zhuǎn)錄酶 1.0 μl、20 U/μl的 RNA 酶抑制劑0.19 μl、100 mmol/L的脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）0.15 μl，加 DEPC溶液補(bǔ)至 20 μl。反應(yīng)條件：37℃ 60 min，95℃5 min，產(chǎn)物置于-20℃冰箱中保存。實(shí)時熒光定量PCR：嚴(yán)格按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μl，冰上依次加入以下試劑：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 1 μl、引物 1 μl、混合物 10 μl，加雙蒸水補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)20 s，95℃反應(yīng)10 s，60℃反應(yīng)20 s，共40個循環(huán)。結(jié)果分析：每組設(shè)3個重復(fù)，根據(jù)△△CT法對結(jié)果進(jìn)行相對定量分析，根據(jù)各樣本的平均 Ct值，采用 2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量。PTX3mRNA的相對表達(dá)量=2-ΔΔCt值（PTX3）-2-ΔΔCt值[甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）]。

1.3.2 蛋白質(zhì)印記法（Westernblot）檢測PTX 3蛋白的相對表達(dá)量 嚴(yán)格按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，根據(jù)PTX3蛋白相對分子質(zhì)量，用合適濃度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，并濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，加入稀釋一抗，4℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-吐溫20緩沖液（trihydroxymethyl aminomethane hydrochloride buffered solution with Tween 20，TBS-T）洗滌3次，加入二抗，室溫孵育2 h，TBS-T洗滌3次。采集化學(xué)發(fā)光圖像，并用Image J軟件對反應(yīng)條帶進(jìn)行灰度分析，PTX3蛋白的相對表達(dá)量=PTX3灰度值/GAPDH灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例數(shù)表示；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTX 3 mRNA及PTX 3蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁正常組織中相對表達(dá)量的比較

PTX3mRNA及PTX3蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的相對表達(dá)量均高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 PTX 3 mRNA及PTX 3蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁正常組織中相對表達(dá)量的比較（±s）

表1 PTX 3 mRNA及PTX 3蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁正常組織中相對表達(dá)量的比較（±s）

組織子宮內(nèi)膜癌組織（n=78）癌旁正常組織（n=78）t值P值PTX3 mRNA相對表達(dá)量4.72±0.27 0.98±0.73 50.047 0.000 PTX3蛋白相對表達(dá)量1.96±0.34 0.49±0.86 25.456 0.000

2.2 不同基線特征子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中PTX 3 mRNA及PTX 3蛋白相對表達(dá)量的比較

臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達(dá)量均明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，不同組織分化程度的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而不同年齡、病理類型、腫瘤直徑、肌層浸潤深度的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同基線特征的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中PTX 3 mRNA及PTX 3蛋白的相對表達(dá)量

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤之一。隨著人們生活方式的改變，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年上升且發(fā)病呈低齡化趨勢，嚴(yán)重威脅女性的身體健康[8]。雖然早期子宮內(nèi)膜癌患者經(jīng)過規(guī)范治療后，5年生存率升高，但晚期、低分化子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后極差，是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌患者死亡的重要因素[9]。PTX是一種可溶性模式識別分子，在免疫應(yīng)答中扮演重要的角色[10]。PTX的特征是環(huán)狀多聚結(jié)構(gòu)，通常呈五聚體，C末端包含由203個氨基酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域，為正五聚蛋白結(jié)構(gòu)域[11]。PTX3是一種急性期反應(yīng)蛋白，在介導(dǎo)體液和抗原免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的作用，參與女性生育、免疫防御、動脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡和血管再生等多種生理病理過程[12-14]。研究顯示，當(dāng)機(jī)體因外部不良刺激產(chǎn)生炎性反應(yīng)時，體內(nèi)多種炎性細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等會產(chǎn)生并釋放PTX3[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，PTX3在肺腺癌組織中的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），且與淋巴癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生率呈正相關(guān)（P＜0.01）[17]。然而，國內(nèi)尚無研究報道PTX3在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能。本研究結(jié)果顯示，PTX3mRNA及PTX3蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的相對表達(dá)量均高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示PTX3表達(dá)上調(diào)可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究進(jìn)一步比較了不同基線特征的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達(dá)量均明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.01）；不同組織分化程度的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜癌組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而不同年齡、病理類型、腫瘤直徑、肌層浸潤深度的子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜組織中PTX3mRNA及PTX3蛋白的相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這提示PTX3表達(dá)不易受個體因素影響，其對子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及組織分化程度的判斷具有一定的臨床價值，可能是子宮內(nèi)膜癌早期診斷的潛在標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。綜上所述，與癌旁正常組織比較，PTX3在子宮內(nèi)膜癌組織中的相對表達(dá)量較高，其可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但本研究的樣本量較少，今后需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究PTX3與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以期為子宮內(nèi)膜癌的臨床診治提供更有價值的參考依據(jù)。