陳李駿，俞繼衛(wèi)，張靈犀#

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院北院麻醉科，上海201999

2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院普外科，上海2019990

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)[1]。由于結(jié)腸癌的早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期。隨著免疫治療、基因治療等綜合治療模式的實(shí)施，一定程度上降低了結(jié)腸癌患者的病死率。嗎啡是臨床常用的一種緩解晚期腫瘤患者癌痛的藥物，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡能夠延長(zhǎng)腫瘤患者的生存時(shí)間，并且其在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡過程中發(fā)揮重要作用[2-3]，因此受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。Qin等[4]研究顯示，外源性嗎啡通過細(xì)胞周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)。而且，嗎啡還能夠抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡[5]。目前，關(guān)于嗎啡對(duì)結(jié)腸癌患者的影響多集中在免疫功能的研究[6]，關(guān)于嗎啡是否影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的研究尚未見報(bào)道。WNT/β-連環(huán)蛋白（βcatenin）信號(hào)通路在進(jìn)化上高度保守，可以參與機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、組織再生、腫瘤和疾病的發(fā)生等多種生理病理過程[7]。已有研究顯示，WNT/βcatenin信號(hào)通路在結(jié)腸癌組織中異常激活，可參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。在大鼠海馬神經(jīng)元慢性嗎啡成癮模型中，WNT/β-catenin信號(hào)通路過度激活[10]，提示嗎啡與WNT/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)。本研究探討嗎啡對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并對(duì)其可能的分子機(jī)制進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞庫；嗎啡注射液購自東北制藥集團(tuán)股份有限公司；F12K培養(yǎng)基、胎牛血清、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑均購自美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶購自杭州四季青生物工程材料有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（annexin V）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國(guó)Abcam公司；電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）檢測(cè)試劑購自美國(guó)Thermo Fisher公司；β-catenin抗體、c-myc抗體、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma/leukemia 2 associated X protein，BAX）抗體、cleaved caspase 3抗體以及二抗均購自美國(guó)CST公司；WNT/β-catenin信號(hào)通路活化劑氯化鋰（lithium chloride，LiCl）購自美國(guó)MP公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

將人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/L青霉素和100 U/L鏈霉素的F12K培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)80%以上時(shí)，采用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞進(jìn)行分組處理：將采用終濃度為100 μmol/L的嗎啡處理的LoVo細(xì)胞記為MorL組；將采用終濃度為500 μmol/L的嗎啡處理的LoVo細(xì)胞記為MorH組；將采用等量F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)的，不用嗎啡處理的LoVo細(xì)胞記為Control組。嗎啡終濃度的設(shè)置依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中嗎啡對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞干預(yù)48 h時(shí)的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。3組細(xì)胞處理后均置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 MTT法檢測(cè)LoVo細(xì)胞的增殖能力

取MorL組、MorH組和Control組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞，以1×104/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)48 h時(shí)分別在每孔細(xì)胞中加入150 μl MTT試劑，繼續(xù)孵育4 h，除去上清液，每孔細(xì)胞中加入100 μl二甲基亞砜，待沉淀完全溶解后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值。計(jì)算3組Lo-Vo細(xì)胞的增殖率，細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A值/Control組A值×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)LoVo細(xì)胞凋亡情況

取MorL組、MorH組和Control組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞，采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞3次，隨后用結(jié)合緩沖液Bing buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，分別在細(xì)胞中添加FITC-Annexin V和PI各5 μl，室溫下避光孵育20 min，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)LoVo細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平

取MorL組、MorH組和Control組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞，分別添加適量蛋白裂解液，置冰上提取細(xì)胞中總蛋白。以BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以上樣緩沖液與蛋白混合，于沸水中加熱10 min致蛋白變性。取等量蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜置于脫脂奶粉封閉液中，封閉1 h，分別加入一抗雜交，其中βcatenin一抗1∶500稀釋，c-myc一抗1∶500稀釋，BAX一抗1∶800稀釋，cleaved caspase 3一抗1∶800稀釋，4℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered solution toween，PBST）洗膜3次后，再加入1∶2000稀釋的二抗，室溫雜交2 h。PBST洗膜3次后，以ECL法顯影，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照，采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6 WNT/ β-catenin信號(hào)通路活化劑LiCl對(duì)嗎啡干預(yù)的LoVo細(xì)胞增殖、凋亡的影響

以20 mmol/L的LiCl處理100 μmol/L嗎啡誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞 48 h，記為MorL+LiCl組。取MorL+LiCl組和MorL組人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，方法同1.3；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，方法同1.4；采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中WNT/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，方法同1.5。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 嗎啡對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖能力的影響

不同濃度（0、100、500 μmol/L）嗎啡處理人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞48 h后，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：MorL組和MorH組LoVo細(xì)胞的增殖率分別為（78.27±5.06）%、（65.09±4.13）%，均低于 Control組的（99.85±6.36）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.563、7.525，P＜0.05）；MorH組細(xì)胞的增殖率低于MorL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.754，P＜0.05）。

2.2 嗎啡對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡情況的影響

不同濃度（0、100、500 μmol/L）嗎啡處理人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：Control組、MorL組和MorH組LoVo細(xì)胞的凋亡率分別為（3.08±0.42）%、（19.84±2.11）%、（28.69±3.06）%。MorL組和MorH組LoVo細(xì)胞的凋亡率均高于Control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.532、14.032，P＜0.05）；MorH組LoVo細(xì)胞的凋亡率高于MorL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.854，P＜0.05）。（圖1）

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組別LoVo細(xì)胞的凋亡情況

2.3 嗎啡對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞WNT/ β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響

不同濃度（0、100、500 μmol/L）嗎啡處理人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示 ：3組 LoVo細(xì) 胞 中 β-catenin、c-myc、BAX、cleaved caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.475、8.976、9.018、13.532，P＜0.01）。MorL組和MorH組LoVo細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于Control組，BAX、cleaved caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于Control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MorH組Lo-Vo細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于MorL組，BAX、cleaved caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于MorL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1、圖2）

表1 3組LoVo細(xì)胞中WNT/ β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（x± s）

圖1 Western blot檢測(cè) 3組LoVo細(xì)胞中WNT/ β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

2.4 LiCl對(duì)嗎啡誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖和凋亡情況的影響

MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：MorL+LiCl組LoVo細(xì)胞的增殖率為（97.23±6.18）%，明顯高于MorL組的（78.68±5.29）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.523，P＜0.01）；MorL+LiCl組LoVo細(xì)胞的凋亡率為（7.22±1.31）%，明顯低于MorL組的（19.47±2.64）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.575，P＜0.01）。

2.5 LiCl對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞WNT/ β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響

采用20 mmol/L LiCl處理嗎啡干預(yù)的LoVo細(xì)胞，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：MorL+LiCl組LoVo細(xì)胞中BAX、cleaved caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于MorL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；MorL+LiCl組LoVo細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于MorL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2、圖3）

表2 兩組LoVo細(xì)胞中WNT/ β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表2 兩組LoVo細(xì)胞中WNT/ β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

組別MorL組MorL+LiCl組t值P值β-catenin 0.51±0.05 0.98±0.10 4.255＜0.01 c-myc 0.30±0.03 0.67±0.07 4.865＜0.01 BAX 0.24±0.03 0.09±0.01 7.853＜0.01 cleaved caspase 3 0.54±0.06 0.14±0.02 12.346＜0.01

圖3 Western blot檢測(cè)LiCl處理的經(jīng)嗎啡誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中WNT/ β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

3 討論

嗎啡是臨床常用于緩解晚期腫瘤患者癌痛的麻醉性鎮(zhèn)痛藥物，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為具有一定的影響[11]。本研究結(jié)果顯示，MorL組和MorH組LoVo細(xì)胞的增殖率均低于Control組，且MorH組細(xì)胞的增殖率低于MorL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明嗎啡對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。此外，嗎啡還能夠誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡。Kim等[12]研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡通過與阿片生長(zhǎng)因子受體相互作用可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖。Ma等[13]研究顯示，嗎啡通過survivin依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在體外可以促進(jìn)人透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌786-O細(xì)胞和RLC-310細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。Chen等[14]的研究顯示，嗎啡能夠通過阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，MorL組和MorH組LoVo細(xì)胞的凋亡率均高于Control組，MorH組LoVo細(xì)胞的凋亡率高于MorL組（P＜0.05），與上述研究嗎啡能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究相類似，說明嗎啡對(duì)于人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖也具有一定的抑制作用。并且進(jìn)一步的研究也顯示，MorL組和MorH組LoVo細(xì)胞中BAX和cleaved caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于Control組，且MorH組LoVo細(xì)胞中BAX和cleaved caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于MorL組（P＜0.05）。BAX是Bcl-2基因家族中促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，其過度表達(dá)能夠使細(xì)胞趨向凋亡。caspase 3是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶之一，是細(xì)胞凋亡過程的執(zhí)行者，caspase 3激活形式cleaved caspase 3的大量形成促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。南振華和潘靈輝[15]的研究結(jié)果顯示，嗎啡通過促進(jìn)caspase 3的表達(dá)抑制人結(jié)腸癌Ec109細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與本研究結(jié)果相似。這進(jìn)一步說明了嗎啡抗結(jié)腸癌的作用。

WNT/β-catenin通路被激活后，可以影響腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，從而引起結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展[16]。相關(guān)研究表明，WNT/β-catenin信號(hào)通路的激活能夠引起β-catenin轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，激活下游靶基因如c-myc、cyclin D1等，從而參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展[17]。多項(xiàng)研究表明，抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18-19]。本研究結(jié)果顯示，MorL組和MorH組LoVo細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于Control組，且MorH組LoVo細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于MorL組（P＜0.05），說明嗎啡通過抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路的激活抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論，本研究使用LiCl激活WNT/β-catenin信號(hào)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MorL+LiCl組LoVo細(xì)胞的增殖率明顯高于MorL組，凋亡率明顯低于MorL組，BAX、cleaved caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于MorL組（P＜0.01），表明LiCl逆轉(zhuǎn)了嗎啡對(duì)LoVo細(xì)胞增殖抑制的作用，減弱了嗎啡對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用，回調(diào)了嗎啡對(duì)LoVo細(xì)胞Bax和cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平的抑制作用。Gaspari等[20]研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡可以通過WNT/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑延緩鎮(zhèn)痛耐受的發(fā)展。另外，Wang等[21]報(bào)道指出，嗎啡可以通過WNT/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑保護(hù)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH62SY5Y細(xì)胞免受分泌蛋白DKK1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究與以上研究結(jié)果相似，說明嗎啡可能通過WNT/β-catenin信號(hào)通路參與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。關(guān)于嗎啡激活WNT/β-catenin信號(hào)通路的具體分子機(jī)制目前尚不清楚，這也是本實(shí)驗(yàn)接下來需探究的方向。

綜上所述，嗎啡能夠在體外抑制人結(jié)腸癌Lo-Vo細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與嗎啡抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路的活化有關(guān)，然而嗎啡激活WNT/β-catenin信號(hào)通路的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。