龔藝貞，廖錫文，阮國(guó)添，閆嶺，馬輝△

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科廣西南寧530021

2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科廣西南寧530021

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是發(fā)生在結(jié)腸或直腸的惡性腫瘤，是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一［1-2］。超過(guò)60%的CRC發(fā)生在結(jié)腸，全球癌癥數(shù)據(jù)顯示2018年新增結(jié)腸癌病例1 096 601 例，死亡551 269 例，約占全部腫瘤的6%［1］。結(jié)腸癌與直腸癌的病因并不一樣［1-4］，所以他們的發(fā)病機(jī)制也可能不同。手術(shù)切除仍是治療結(jié)腸癌的主要手段，但大部分患者診斷時(shí)已非早期，術(shù)后生存期不長(zhǎng)。良好的腫瘤標(biāo)記物有助于腫瘤的早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)。之前的研究發(fā)現(xiàn)血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是對(duì)CRC 診斷和術(shù)后監(jiān)測(cè)較有意義的腫瘤標(biāo)記物［5-7］，但是，CRC患者的血清CEA 陽(yáng)性率在一些臨床試驗(yàn)中低于50%［8-10］。因此，有必要尋找更好的生物學(xué)標(biāo)志物以利于早期診斷結(jié)腸癌和預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。結(jié)腸癌中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型是結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma，COAD），本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的COAD 數(shù)據(jù)集探索RUVBL1基因表達(dá)在COAD中的診斷和預(yù)后價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的來(lái)源

從TCGA（https://cancergenome.nih.gov；訪問(wèn)日期：2018年12月29日）下載COAD 的mRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)集及病例相應(yīng)的臨床資料［11-12］。通過(guò)RUVBL1 基因在COAD 患者癌和癌旁正常結(jié)腸組織中的表達(dá)情況計(jì)算其表達(dá)差異及診斷價(jià)值。根據(jù)納入樣本RUVBL1基因表達(dá)量的中位數(shù)進(jìn)行分組，其表達(dá)量高于中位值的定義為高表達(dá)組，反之為低表達(dá)組［13-14］，分析RUVBL1基因在COAD中的預(yù)后價(jià)值。本研究使用TCGA 數(shù)據(jù)符合TCGA 的出版指南（https://www.cancer.gov/about- nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga/using-tcga/citing-tcga），不需要倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 7.0 軟件（GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA）繪制散點(diǎn)圖、ROC 曲線和Kaplan-Meier 生存曲線。采用SPSS 22.0 版本（SPSS, Inc, Chicago, IL, USA） 行t 檢驗(yàn)比較RUVBL1 基因在癌組織和癌旁正常結(jié)腸組的中的表達(dá)量，臨床參數(shù)與COAD 預(yù)后的關(guān)系采用單因素與多因素Cox 風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行分析，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（Hazard Ratio，HR）與95%置信區(qū)間（95% Confidence Interval，95% CI）量化評(píng)估臨床參數(shù)與COAD 臨床預(yù)后的相關(guān)性，為減小兩組間選擇性偏倚，作者將單因素分析中P ＜0.05的因素進(jìn)行校正后再進(jìn)行Cox 多因素分析。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RUVBL1基因在癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)

TCGA 中的結(jié)腸腺癌研究項(xiàng)目共有461 例COAD患者，其中456例患者的480個(gè)癌組織樣本和41個(gè)癌旁正常組織樣本有mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，RUVBL1基因在癌組織中的表達(dá)量為（2486.000 ± 39.590），高于其在癌旁正常結(jié)腸組織中的表達(dá)量（966.300 ±35.450），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.001）。見(jiàn)圖1A。

2.2 RUVBL1基因表達(dá)對(duì)COAD的診斷價(jià)值

以RUVBL1 基因在癌組織和癌旁正常結(jié)腸組的中的表達(dá)量繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示RUVBL1 基因?qū)OAD有較高的診斷價(jià)值（AUC=0.972，95%CI:0.958～0.986）。見(jiàn)圖1B。

2.3 RUVBL1基因表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)系

臨床資料含有461例COAD患者，排除有臨床資料而無(wú)mRNA 表達(dá)量數(shù)據(jù)的5 例，有RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)而無(wú)患者臨床資料的2例、術(shù)后生存時(shí)間為未知的1例，以及術(shù)后生存時(shí)間為0的15例，最后納入438例既有生存資料又有全基因組RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)集的COAD患者進(jìn)行生存分析。

2.3.1 RUVBL1 基因表達(dá)與總生存時(shí)間的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示RUVBL1基因表達(dá)與總生存時(shí)間相關(guān)，低表達(dá)患者總體生存時(shí)間優(yōu)于高表達(dá)患者（P=0.027）。見(jiàn)圖1C。

2.3.2 影響COAD 患者預(yù)后的臨床參數(shù)單因素及多因素Cox分析以生存結(jié)局（“生存”賦值0，“死亡”賦值1）為因變量，以性別（“男”賦值1，“女”賦值2）、年齡（“≤65歲”賦值1，“＞65歲”賦值2）、TNM分期（“I期”賦值1，“II期”賦值2，“III期”賦值3，“IV期”賦值4）及RUVBL1表達(dá)（“低表達(dá)”賦值1，“高表達(dá)”賦值2）為自變量對(duì)影響結(jié)腸癌預(yù)后的因素進(jìn)行單因素及多因素Cox分析。

單因素分析結(jié)果顯示患者性別、年齡均與患者的預(yù)后無(wú)關(guān)（Log-rank P = 0.545、0.114），而腫瘤TNM 分期（P ＜0.001）、RUVBL1 基因表達(dá)與COAD預(yù)后相關(guān)（Crude P=0.028；Crude HR=1.587，95%CI:1.051～2.397）。進(jìn)一步進(jìn)行校正腫瘤TNM 分期的Cox多因素分析，結(jié)果顯示RUVBL1基因高表達(dá)是影響COAD 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（Adjusted P = 0.038；Adjusted HR=1.565；95%CI:1.026～2.386）。見(jiàn)表1。

3 討論

CRC 治療越早期效果越好，早期患者的存活率大約是晚期患者的5倍［15］，而在最初診斷CRC時(shí)，I期患者僅占15%［16］。結(jié)腸鏡檢查鉗取組織行病理檢查仍然是術(shù)前診斷CRC 的金標(biāo)準(zhǔn)，但這項(xiàng)檢查具有侵入性，費(fèi)用昂貴，患者依從性差。理想的腫瘤標(biāo)記物對(duì)腫瘤的診斷具有較高的靈敏度和特異度，有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，然而既往對(duì)CRC 生物學(xué)標(biāo)記物的研究并未獲得理想的結(jié)果［17-22］，在CRC 的預(yù)后研究方面，目前研究發(fā)現(xiàn)一些有助于預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志物用于篩查復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)［23-24］。但是它們?cè)谂R床應(yīng)用受限，并且由于檢測(cè)技術(shù)和費(fèi)用問(wèn)題，一些檢測(cè)手段僅能在規(guī)模較大的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中實(shí)施。TNM分期是預(yù)測(cè)預(yù)后的一個(gè)重要因素，但該分期系統(tǒng)在COAD臨床應(yīng)用中仍具有一定的局限性，仍然需要尋找效能更高的分子標(biāo)志物對(duì)TNM 分期系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)充，以便對(duì)COAD進(jìn)行更有效的診療［25-27］。

RUVBL1 基因編碼一種同時(shí)具有DNA 依賴(lài)性ATP 酶和DNA 螺旋酶活性的蛋白質(zhì)，屬于與多種細(xì)胞活性（AAA+）蛋白質(zhì)家族相關(guān)的ATP酶。編碼蛋白與幾個(gè)亞單位轉(zhuǎn)錄復(fù)合物以及參與ATP 依賴(lài)性重塑和組蛋白修飾的蛋白復(fù)合物相關(guān)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=(ruvbl1 ［gene］)%20AND%20(Homo% 20sapiens ［orgn］)% 20AND% 20alive［prop］%20NOT%20newentry［gene］&sort=weight）。既往的研究發(fā)現(xiàn)RUVBL1 參與了多種細(xì)胞過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑和DNA 損傷修復(fù)［28-29］，RUVBL1基因在多種惡性腫瘤中高表達(dá)并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程并預(yù)示著不良的預(yù)后［30-33］。Lauscher等人對(duì)115 例UICCⅡ期和Ⅲ期的原發(fā)性結(jié)腸腺癌組織RUVBL1蛋白免疫組化研究結(jié)果提示，接受輔助治療的RUVBL1 陽(yáng)性結(jié)直腸癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率（P =0.008）和總生存率（P=0.011）低于接受輔助治療的RUVBL1 陰性患者。在UICCⅢ期的結(jié)直腸癌中，RUVBL1 陽(yáng)性結(jié)直腸癌無(wú)復(fù)發(fā)生存率下降（P =0.028）［34］。本研究結(jié)果顯示RUVBL1基因?qū)OAD患者有較高的診斷價(jià)值，且其在癌組織中高表達(dá)可增加COAD 患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)，其總體生存時(shí)間較低表達(dá)RUVBL1基因的COAD患者更短，因此初步認(rèn)為其可作為一個(gè)具有潛力的結(jié)腸腺癌診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)記物。

圖1 RUVBL1基因在COAD患者癌組織和癌旁正常組織中表達(dá)情況及其在COAD患者癌組織中表達(dá)的高低與預(yù)后的生存分析

表1 影響COAD患者預(yù)后的臨床參數(shù)單因素及多因素Cox分析

本研究發(fā)現(xiàn)RUVBL1 基因可能在結(jié)腸腺癌診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)方面有一定的指導(dǎo)意義，但本研究仍存在一些局限性：（1）來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床信息不完善，一些重要的信息如腫瘤大小、組織學(xué)分型、分化程度等未能提供；（2）本研究的樣本量有限，未來(lái)需要在更大樣本人群和多中心、多區(qū)域、多民族人群中進(jìn)行驗(yàn)證；（3）需要進(jìn)行功能試驗(yàn)，進(jìn)一步探討RUVBL1 基因在COAD 的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、增殖和血管生成中的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果提示RUVBL1 基因可能是COAD 診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后潛在的生物學(xué)標(biāo)記物，但是該結(jié)果仍需要在未來(lái)更進(jìn)一步的大樣本和多中心隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。