李瓊瓊，王立民，徐夢思，萬科幸，黃瑾，王成坦，毛福秀，高蕊*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002； 2 新疆農(nóng)墾科學(xué)院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000)

以色列科學(xué)家Nedivi于1993年首次在大鼠海馬齒狀腦回cDNA 文庫中克隆出Neuritin基因[1]。隨后，其又發(fā)現(xiàn)光刺激可誘導(dǎo)大鼠視覺皮質(zhì)中可塑性相關(guān)候選基因15的表達[2]。時隔四年，Naeve等人再次從人類大腦皮質(zhì)cDNA 文庫中篩選并鑒定出該基因，發(fā)現(xiàn)其純化蛋白具有促進神經(jīng)突起的快速生長和加速分支形成的作用，因此將其正式命名為Neuritin[3]。Neuritin基因富集表達于腦組織，在不同發(fā)育階段，Neuritin的表達區(qū)域亦有所變化：發(fā)育過程中，Neuritin主要表達于皮質(zhì)、海馬、大腦的感覺區(qū)；在成年期，則主要表達在與可塑性相關(guān)的神經(jīng)區(qū)域，如海馬、嗅球、蒲肯野氏細胞中[3-5]。大量研究表明，Neuritin不僅能促進神經(jīng)突起的生長及其分支的形成，促進突觸的發(fā)育成熟，調(diào)節(jié)突觸回路的形成，還能促進神經(jīng)元的遷移，抑制神經(jīng)細胞凋亡，維持神經(jīng)元的存活[4, 6-9]。

啟動子區(qū)域是參與真核生物的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的重要區(qū)域，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10]。由于第四版大鼠基因組Neuritin基因啟動區(qū)域組裝有誤(RGSC 6.0/rn6)，迄今為止仍未見大鼠Neuritin基因啟動子序列與啟動Neuritin轉(zhuǎn)錄活性的文獻報道。相關(guān)Neuritin基因表達調(diào)控的研究主要集中在在誘導(dǎo)表達上，研究發(fā)現(xiàn)Neuritin的表達調(diào)控在胚胎發(fā)育期是非活動依賴的，而在出生后至成年期，Neuritin的激活區(qū)域與神經(jīng)活動依賴的可塑性相關(guān)區(qū)域相重疊[11-13]，除了KA[3]、光線刺激[1]、突觸活動[14]、BDNF[15]、NGF[16]、GDNF[17]可誘導(dǎo)Neuritin基因表達外，雄激素[18]和神經(jīng)興奮劑[19]也可誘導(dǎo)Neuritin基因的表達；而在脊髓損傷[20]、缺氧[21]、腦外傷[22]、電驚厥治療[23]、抗抑郁藥[24-25]作用后Neuritin的表達也出現(xiàn)了上調(diào)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)全腦短暫性缺血再灌注模型大鼠Neuritin基因表達顯著升高，且其表達水平的變化趨勢恰好與機體的修復(fù)程度呈正相關(guān)[26-28]。

基于以上研究背景。本研究根據(jù)物種的同源性設(shè)計引物克隆大鼠Neuritin啟動子區(qū)域序列，并采用Sanger測序技術(shù)對其序列進行鑒定，利用生物信息學(xué)方法分析其序列特征，預(yù)測啟動子主要調(diào)控區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，為進一步深入研究其表達調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

成年健康Sprague-Dawley大鼠購買于新疆疾病預(yù)防與控制中心，體重約200 g，取0.5 cm鼠尾剪碎，用于提取組織總DNA。

1.2 試驗試劑

Tris堿、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、氯化鈉(NaCl)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、濃鹽酸、Tris平衡酚、氯仿(三氯甲烷)以及瓊脂糖為實驗室留存試劑。青霉素、鏈霉素購自于Invitrogen公司。高保真酶購自天根生化(北京)有限公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自全式金生物技術(shù)有限公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小抽提試劑盒、高糖DMEM細胞培養(yǎng)基及胎牛血清購于OMEGA公司；pMDTM19-T載體、LA酶購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA提取

采用苯酚-氯仿抽提法提取大鼠鼠尾組織基因組DNA，75%的乙醇洗滌2次，ddH2O溶解基因組至終濃度為200 ng/μL，OD260/280比值為1.8-2.0，基因組DNA于-20 ℃。

1.3.2 大鼠Neuritin基因5’調(diào)控區(qū)引物設(shè)計

以小鼠Neuritin基因CDS區(qū)上游3000 bp的堿基序列為參考序列，采用比較基因組學(xué)的方法同第四版大鼠基因組Neuritin基因啟動子區(qū)域進行比較，采用oligo 6.0軟件針對涵蓋大鼠Neuritin基因啟動子的上、下游保守序列設(shè)計引物，由Invitrogen公司合成，引物信息如下：

PFnrn1∶5’-CCGCTCGAGGTCAAACCATTTGCGACCGCAGACC-3’。

PRnrn1∶5’- CTAGCTAGCGAAGGGGAAAGCATCCTTTACCCCT-3’。

1.3.3 大鼠Neuritin基因5’調(diào)控區(qū)PCR擴增和測序

以大鼠基因組DNA為模板進行擴增，PCR反應(yīng)體系為50 μL：LA酶和高保真酶各0.5 μL，LA Buffer 5 μL，dNTP 8 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 33 μL。擴增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃ 10 s，68 ℃ 3min共進行40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。將回收產(chǎn)物克隆入pMDTM19-T Vector載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送新疆昆泰銳生物公司測序。

1.3.4 大鼠Neuritin基因5′ 調(diào)控區(qū)生物信息學(xué)分析

利用啟動子生物信息學(xué)軟件EMBOSS Cpgplot(http://www.e bi.ac.uk/Tool s/seqstats/e mboss_cpgplot/)和Promoter Scan(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan)對大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列進行預(yù)測分析，初步確定啟動子核心調(diào)控區(qū)域。

1.3.5 大鼠Neuritin基因啟動子主要調(diào)控區(qū)域生物信息學(xué)分析

利用Promoter scan，AliBaba2.0，TRBIND，Match 1.0 Public及TFSEARCH(表1)等生物信息學(xué)軟件預(yù)測大鼠Neuritin基因啟動子主要調(diào)控區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。

表1 啟動子在線分析軟件Tab.1 Online softwares for promoter analyzing

2 結(jié)果

2.1 大鼠Neuritin基因5′ 調(diào)控區(qū)擴增及序列的測序

以大鼠鼠尾組織基因組DNA為模板，對預(yù)設(shè)的大鼠Neuritin基因啟動子區(qū)域進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，擴增得到一條大小約為3400 bp的特異性條帶(圖1)。Neuritin擴增片段純化后連接至 T 載體、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞、涂板、挑取單一菌落，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用XhoⅠ和NheⅠ限制性核酸內(nèi)切酶初步鑒定出陽性克隆(圖2)。陽性質(zhì)粒送測序公司測序，測序結(jié)果與大鼠

Neuritin基因完全一致，鑒定為大鼠Neuritin基因5′ 調(diào)控區(qū)序列(圖3)。

M：1 kb Marker；1：PCR擴增產(chǎn)物圖1 大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis chart of 5′ regulatory region of Rat Neuritin

M： 1 kb Marker； 1：重組質(zhì)粒pMD19-Nrn1-promoter； 2： XhoⅠ單酶切(6140 bp)；3： NhoⅠ單酶切(6140 bp)； 4：雙酶切(2693 bp；3447 bp)圖2 Neuritin啟動子區(qū)域重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant vectors of Neuritin promoter region by restriction enzymes

圖3 大鼠Neuritin啟動子區(qū)域陽性質(zhì)粒部分序列測序圖譜Fig.3 Sequencing of partial sequences of positive plasmid of rat Neuritin promoter region

2.2 大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列分析

對陽性質(zhì)粒測序后的堿基組成進行分析，大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列中A、T、G、C堿基含量分別為21.4%、24.9%、26.1%和27.6%，其中A+T含量為46.3%，G+C含量為53.7%。同源性分析發(fā)現(xiàn)，大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列與人和小鼠的一致性分別為92.9%和91.1%。

利用Promoter Scan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)在大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列CDS區(qū)上游224 bp處有一個TATA 盒，并預(yù)測了多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。利用EMBOSS Cpgplot在線工具檢索了所克隆的約3447 bp啟動子區(qū)域的CpG島，進一步發(fā)現(xiàn)距大鼠NeuritinCDS區(qū)上游740～1012 bp位置處有一個CpG島(圖4、圖5)。據(jù)此初步證實Neuritin基因核心啟動子位于Neuritin基因起始位點前1100 bp的上游片段。

下劃線為為CpG島，加粗字體灰色為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，加粗灰色斜體為TATA-Box圖4 大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)核苷酸序列Fig.4 Sequences of 5′regulatory region in Rat Neuritin

圖5 大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)CpG島預(yù)測結(jié)果Fig.5 Prediction of CpG islands in 5′ regulatory region of Rat Neuritin

2.3 大鼠Neuritin基因啟動子主要調(diào)控區(qū)域轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點生物信息學(xué)分析

依據(jù)上述以上的分析結(jié)果，進一步利用五款轉(zhuǎn)錄因子分析軟件(Promoter scan，AliBaba2.0，TRBIND，Match 1.0 Public和TFSEARCH)對大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)1100 bp的核心啟動子區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點生物信息學(xué)分析，我們采用嚴苛的求五種預(yù)測軟件預(yù)測結(jié)果的交集的方法，最終篩選出與Neuritin基因啟動相結(jié)合的候選轉(zhuǎn)錄因子。對于預(yù)測得出交集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，進一步將這些位點序列與小鼠和人的序列進行比較，將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點同源性高的轉(zhuǎn)錄因子作為最終候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。結(jié)果顯示共篩選出CREB，AP-1，GATA-1，AP-2，AP-4，RAP1，MCM1和Pit八個轉(zhuǎn)錄因子(表2)。

表2 五款轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件預(yù)測的結(jié)果(交集)Tab.2 Prediction results of five transcription factor prediction softwares (intersection)

3 討論

有關(guān)Neuritin表達調(diào)控機制的研究十分有限，現(xiàn)有的研究表明Neuritin基因的表達調(diào)控機制存在3種不同的途徑：(1)神經(jīng)營養(yǎng)因子的誘導(dǎo)途徑，當(dāng)外源性BDNF作用于神經(jīng)元時，可通過TrkB 受體途徑激活Neuritin的表達，但阻斷TrkB 受體后只阻斷BDNF對Neuritin的激活，而不影響KCL誘導(dǎo)Neuritin表達的作用[3]。(2)神經(jīng)活動的獨立誘導(dǎo)途徑，神經(jīng)活動可激活N-甲基-D-天(門)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA) 受體，通過開放電壓門控的L型鈣通道，引發(fā)胞外鈣離子內(nèi)流，促使細胞內(nèi)鈣離子濃度迅速增加，激活鈣調(diào)蛋白結(jié)合的靶標蛋白鈣調(diào)蛋白激酶(CaM kinases)和細胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 通路，獨立誘導(dǎo)Neuritin的表達[33]。該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可被鈣調(diào)蛋白激酶抑制劑制 KN-62 所阻斷，但卻不能阻斷BDNF對Neuritin基因的激活作用[13]。(3)對Neuritin基因轉(zhuǎn)錄后水平表達調(diào)控途徑的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元特異性的RNA結(jié)合蛋白Hud蛋白與Neuritin的表達存在一定相關(guān)性，Hud蛋白能夠結(jié)合到Neuritin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’非翻譯區(qū)的AU富集區(qū)，從而參與Neuritin基因的表達[29]。Akten等[30]發(fā)現(xiàn)，運動神經(jīng)元生存(survival motor neuron, SMN)蛋白可與Hud蛋白形成復(fù)合體，通過調(diào)控Neuritin基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達，參與挽救脊髓性肌萎縮癥中運動神經(jīng)元軸突的缺失。在表觀調(diào)控機制方面，本課題組利用Solexa高通量測序技術(shù)對全腦短暫性缺血再灌注和正常對照的大鼠腦組織小RNA進行測序[28]，篩選出差異表達的miRNA，并應(yīng)用雙熒光素報告系統(tǒng)及細胞水平實驗，驗證了miR-204在轉(zhuǎn)錄后水平對Neuritin基因具有負向調(diào)控作用[31]。

啟動子是基因的重要組成部分，是真核生物基因表達調(diào)控的順式作用元件，控制基因表達的起始時間和表達豐度[10]。因此，了解啟動子的功能活性對于研究基因的表達調(diào)控十分重要。由于UCSC數(shù)據(jù)庫上大鼠Neuritin基因啟動子存在拼接錯誤，本研究根據(jù)比較基因組設(shè)計在小鼠和大鼠基因組上均高度保守的上、下游引物擴增大鼠Neuritin基因CDS區(qū)上游3447 bp的堿基序列，大鼠Neuritin基因啟動子所克隆的序列與小鼠的同源性高達91.1%，與人的Neuritin基因啟動子序列的同源性高達93%，其序列的同源性與人更為接近。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)大鼠Neuritin基因5′調(diào)控區(qū)序列CDS區(qū)上游224 bp處存在典型的TATA-Box。TATA-Box是存在于真核生物啟動子中很常見的一種順式作用元件，它存在于由RNA聚合酶Ⅱ所轉(zhuǎn)錄的大多數(shù)真核生物基因的近端啟動子中，TATA-Box可以與其他啟動子元件聯(lián)合起作用，一起調(diào)控啟動子的轉(zhuǎn)錄活性[32]。本研究還發(fā)現(xiàn)距大鼠NeuritinCDS區(qū)上游1100-850 bp位置處有一個CpG島，CpG島含有豐富的CG堿基，易于發(fā)生DNA甲基化，提示大鼠Neuritin基因的表達調(diào)控可能還涉及到表觀遺傳修飾，如甲基化修飾的調(diào)節(jié)。本研究還對Neuritin基因CDS區(qū)上游1100 bp的核心啟動子區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析，篩選出CREB，AP-1，GATA-1，AP-2，AP-4，RAP1，MCM1和Pit 8等八個轉(zhuǎn)錄因子。物種同源性比對性結(jié)果顯示CREB和AP-1的結(jié)合位點序列與人和小鼠Neuritin啟動子序列同源性較高。大量研究表明轉(zhuǎn)錄因子CREB在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、抑郁、成癮性、生理周期中，特別是在長時程記憶過程中具有重要作用[33]，其可能在Neuritin基因的表達調(diào)控中扮演重要角色。

本研究鑒定了大鼠Neuritin基因的啟動子區(qū)域，這不僅對于深入闡Neuritin基因的表達調(diào)控機制奠定了堅實的基礎(chǔ)，而且也有助于進一步解釋Neuritin基因在神經(jīng)受損后的再生中過程中行駛的生物學(xué)功能。