李研，劉慧，黃先忠

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，特色植物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832003)

植物的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding proteins,PEBP)基因家族，主要起著促進(jìn)或抑制開(kāi)花和控制株型的作用。PEBP家族包含MOTHEROFFTANDTFL1(MFT)，F(xiàn)LOWERINGLOCUST(FT)，TERMINALFLOWER1(TFL1)3個(gè)亞家族[1-3]，其中，F(xiàn)T和TFL1兩個(gè)亞家族都是起源于MFT，BROTHEROFFTANDTFL1(BFT)屬于TFL1亞家族，大多數(shù)植物PEBP家族蛋白含有保守的真核生物特異性區(qū)域[4]。目前的研究[5]認(rèn)為，PEBP蛋白在細(xì)胞核中能與一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子FD蛋白互作，從而抑制花分生組織基因的表達(dá)，起著維持無(wú)限生長(zhǎng)、抑制開(kāi)花轉(zhuǎn)變的作用。在動(dòng)物中PEBP蛋白主要是Raf激酶抑制劑的作用。在很多植物中也發(fā)現(xiàn)了PEBP蛋白，例如擬南芥、金魚(yú)草、葡萄、白楊樹(shù)、豆科植物、大麥、番茄、水稻、玉米。

植物中的TFL1亞家族基因成員大多具有相似的基因結(jié)構(gòu)，均由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成[6]，這說(shuō)明該基因家族在進(jìn)化中基因結(jié)構(gòu)較為保守。保守的磷脂酰乙醇胺結(jié)構(gòu)域是FT/TFL1基因家族成員編碼的蛋白所共有，因可在體外結(jié)合磷脂酰乙醇胺而得名，在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在[7-9]。開(kāi)花是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，受植物內(nèi)部遺傳基因和外部環(huán)境因素的共同誘導(dǎo)和調(diào)控，其中與開(kāi)花有關(guān)的基因成為調(diào)控成花轉(zhuǎn)變的重要遺傳因子。在PEBP家族基因中FT亞家族基因和BFT1所在的TFL1亞家族基因共同調(diào)控開(kāi)花轉(zhuǎn)變，目前很多研究顯示FT促進(jìn)開(kāi)花，TFL1抑制開(kāi)花。植物在受到逆境脅迫后通常會(huì)提前開(kāi)花，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，因此逆境下調(diào)控開(kāi)花轉(zhuǎn)變十分重要。BFT能夠在擬南芥中調(diào)控開(kāi)花就是一條非常重要的途徑，有研究[10]表明擬南芥在正常的條件下進(jìn)入開(kāi)花轉(zhuǎn)變階段時(shí)，F(xiàn)T就會(huì)與FD相互作用來(lái)促進(jìn)AP1的轉(zhuǎn)錄，而受到外源高鹽脅迫時(shí)，BFT就會(huì)與FT相互競(jìng)爭(zhēng)FD來(lái)抑制AP1的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控?cái)M南芥的開(kāi)花時(shí)間，這一過(guò)程需要更多的BFT蛋白，并且在這種高鹽脅迫下，BFT基因介導(dǎo)的FT-FD模型，就可以提供合適的保護(hù)機(jī)制適應(yīng)光周期途徑并促使植物開(kāi)花[11]。本研究克隆了GhBFT1基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式的分析，以期為該基因后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本氏煙草(N.benthamiana)，棉花新陸早33號(hào)品種的不同組織材料：棉花生長(zhǎng)1個(gè)月的幼苗時(shí)期取根部、莖稈、真葉組織，開(kāi)花時(shí)取花瓣、萼片、雄蕊。胚珠材料的取樣時(shí)間：開(kāi)花前3天(-3)、開(kāi)花當(dāng)天(0)、和花后1、3、5、8、12、16、20天。

1.2 方法

1.2.1 棉花DNA和RNA的提取

選取陸地棉品種新陸早33成熟葉片為材料，液氮速凍后采用CTAB法進(jìn)行基因組DNA的提取，使用植物RNA提取試劑盒提取棉花總RNA[12]。

1.2.2 陸地棉GhBFT1基因的克隆

根據(jù)全基因組分析獲得陸地棉BFT1基因的開(kāi)放讀碼框(Open reading frame,ORF)，使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)好擴(kuò)增引物(表1)。ORF擴(kuò)增引物分別為：KpnI-GhBFT1F和BamH I-GhBFT1R，由華大基因公司合成。以提取棉花的DNA為模板，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，將大小正確的啟動(dòng)子DNA 片段以快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收并克隆到中間載體pMD18-T上，之后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒然后經(jīng)過(guò)酶切鑒定。

1.2.3 陸地棉BFT1基因的生物信息學(xué)分析

棉花BFT1基因的查找與分析參照魏艷玲等[13]的方法，用MegAlign程序比對(duì)分析，得到基因結(jié)構(gòu)完整的CDS序列，并找到最大ORF。測(cè)序結(jié)果使用DNAstar軟件分析，使用Clustal W和GeneDoc等軟件對(duì)所獲得的蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。利用SWISS-MODEL網(wǎng)站對(duì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用NCBI網(wǎng)站中的blastn工具，以擬南芥的BFT/TFL1家族基因成員的氨基酸序列，搜索其他物種基因組上的BFT/TFL1家族基因成員，下載序列后，利用MEGA5.1軟件對(duì)各物種中的BFT/TFL1家族基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，用Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，1000次重復(fù)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析陸地棉GhBFT1基因的表達(dá)情況

根據(jù)GhBFT1的ORF序列設(shè)計(jì)基因表達(dá)分析的特異引物GhBFT1-RT-F和GhBFT1-RT-R，內(nèi)參基因使用棉花的Ubiquitin7(GenBanK登錄號(hào)為DQ116441)基因，引物名稱(chēng)UBQ7-F和UBQ7-R(表1)。參照鄭麗潔等[14]采用qRT-PCR來(lái)分析基因表達(dá)，分析溶解曲線(xiàn)，檢測(cè)每份樣品的目的基因和UBQ7內(nèi)參基因的Ct值，每種樣品進(jìn)行3次PCR重復(fù)，采用2-ΔCt法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，先分別計(jì)算出每組的ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，再根據(jù)ΔCt值求出2-ΔCt以及標(biāo)準(zhǔn)誤，使用t測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)分析，采用Excel2010軟件分析數(shù)據(jù)和作圖。

表1 本研究設(shè)計(jì)引物名稱(chēng)及信息Tab.1 Primers designed and used in this experiment

1.2.5 植物融合表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草的轉(zhuǎn)化

以測(cè)序正確的pMD18-T∶GhBFT1質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增去除終止密碼子TGA的GhBFT1基因片段，反應(yīng)體系和程序參照上面的方法。酶切鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序分析有無(wú)發(fā)生堿基的改變，將測(cè)序正確質(zhì)粒經(jīng)KpnI和BamH I雙酶切，回收片段，同時(shí)用同樣的雙酶切帶有GFP的pCAMBIA2300載體，回收質(zhì)粒大片段。將以上回收產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將構(gòu)建好的GFP融合表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中。

本氏煙草(N.benthamiana)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的煙草進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，轉(zhuǎn)化前澆透水，活化帶有基因載體的農(nóng)桿菌，離心收集菌體。配制好懸濁液，室溫靜置3 h。侵染時(shí)注射器吸取菌液在煙草葉片下表面將菌液注射，3～5 d后切取注射部位在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。同時(shí)以35S∶GFP做為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉GhBFT1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

GhBFT1基因cDNA的ORF長(zhǎng)約500 bp左右(圖1)，經(jīng)克隆測(cè)序，分析得出GhBFT1的ORF長(zhǎng)度為525 bp，包含起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，比對(duì)分析和陸地棉基因組中注釋的來(lái)自A亞基因組的基因GhBFT1-A，來(lái)自D亞基因組的基因GhBFT1-D分別有99.2%和99.6%的相似性(圖2)。推測(cè)ORF編碼174個(gè)氨基酸，氨基酸比對(duì)分析表明GhBFT1蛋白具有PEBP家族中保守氨基酸位點(diǎn)His88/Asp144 (圖3)。使用SWISS-MODEL網(wǎng)站同源建模法構(gòu)建GhBFT1蛋白三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其與TFL1家族蛋白的結(jié)構(gòu)很類(lèi)似(圖4)，GhBFT1蛋白含有4個(gè)反向平行的肽鏈形成一個(gè)中心β折疊片，還有其他一些無(wú)規(guī)則卷曲的線(xiàn)性骨架。將GhBFT1的氨基酸序列與其它植物BFT蛋白家族進(jìn)行比對(duì)分析，并將棉花BFT基因與其他物種BFT同源基因的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5),可看出，擬南芥、亞麻薺、油菜的BFT基因進(jìn)化親緣關(guān)系最為接近，而棉花BFT基因與番木瓜(Caricapapaya)、榴蓮(Duriozibethinus)、哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)、可可(Theobromacacao)等的基因進(jìn)化親緣關(guān)系比較接近。BFT基因所處的TFL1亞家族基因在進(jìn)化上表現(xiàn)出分支相互交錯(cuò)的現(xiàn)象，沒(méi)有根據(jù)親緣系各自聚類(lèi)，且部分單子葉植物和雙子葉植物的BFT與TFL1同源基因的進(jìn)化分支雖各自聚成一類(lèi)，但沒(méi)有明顯分界線(xiàn)，說(shuō)明TFL1亞家族基因的進(jìn)化相對(duì)較快、分化更大，這對(duì)基因功能進(jìn)化的多樣性具有重要意義。

M:DNA分子量marker DL2000圖1 GhBFT1基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 The PCR product of GhBFT1 gene

2.2 陸地棉GhBFT1基因的組織表達(dá)分析

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，GhBFT1基因在陸地棉中根、莖、真葉、花瓣、花萼和雄蕊中均有表達(dá)(圖6A)，但不同組織中的相對(duì)表達(dá)量水平顯示出明顯差異：GhBFT1基因在花蕊中表達(dá)量最高，其次是根，這2個(gè)組織中的表達(dá)量明顯高于其他組織；在葉和花萼中表達(dá)量中等；在莖和花瓣中表達(dá)量較少，并且表達(dá)量差異不顯著，說(shuō)明表達(dá)水平相當(dāng)。組織表達(dá)分析表明GhBFT1基因可能在棉花根的發(fā)育和花蕊的形成過(guò)程中起著更為重要的作用。

雖然GhBFT1基因在棉花根及花蕊中的相對(duì)表達(dá)水平最為突出，但GhBFT1基因在胚珠和纖維的發(fā)育時(shí)期也有表達(dá)。分析GhBFT1基因在胚珠發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在開(kāi)花前3天(-3)以及開(kāi)花3天(3)后，GhBFT1都處于比較低的表達(dá)水平，而在開(kāi)花當(dāng)天(0)、花后1天(1)表達(dá)水平都相對(duì)較高，開(kāi)花后基因表達(dá)逐漸降低(圖6B)，說(shuō)明GhBFT1基因可能在根和雄蕊發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，同時(shí)參與了棉花纖維發(fā)育及胚珠發(fā)育。

圖3 GhBFT1基因編碼的氨基酸的序列比對(duì)分析Fig.3 The amino acids alignment of GhBFT1 gene

圖4 GhBFT1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Three-dimensional structure prediction of GhBFT1 protein

2.3 亞細(xì)胞定位分析

2.3.135S∶GhBFT1-GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

載體含有卡那霉素抗性基因nptII和花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子(圖7A)。將構(gòu)建好的載體酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物除載體片段外，另有一約500 bp的條帶(圖7B)，是GhBFT1基因去除終止子的片段，說(shuō)明35S∶GhBFT1-GFP質(zhì)粒構(gòu)建正確。轉(zhuǎn)化35S∶GhBFT1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳顯示也擴(kuò)增出了預(yù)期大小的條帶(圖7C)，說(shuō)明35S∶Gh-BFT1-GFP載體轉(zhuǎn)化成功，可以用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化和亞細(xì)胞定位研究。

圖5 不同植物基因組中的BFT基因編碼的氨基酸序列進(jìn)化分析Fig.5 Evolutionary analysis of BFT genes coding amino acids in various plant genomes

A：組織表達(dá)分析；B：纖維不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析；相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著，數(shù)字代表開(kāi)花天數(shù)圖6 GhBFT1基因的表達(dá)分析Fig.6 Gene expression analysis of GhBFT1

A:35S∶GhBFT1-GFP酶切鑒定；B:菌液PCR驗(yàn)證；C:融合表達(dá)載體的模式圖圖7 35S∶GhBFT1-GFP植物融合載體構(gòu)建Fig.7 Plant fusion vector construction of 35S∶GhBFT1-GFP

2.3.2 GhBFT1蛋白的亞細(xì)胞定位

將35S∶GhBFT1-GFP使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至本氏煙草葉片中，使其基因在煙草的葉表皮細(xì)胞中表達(dá)，使用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在葉表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中有綠色熒光信號(hào)，與GFP空白對(duì)照結(jié)果一致(圖8)。GFP蛋白在植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，說(shuō)明GhBFT1蛋白是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的蛋白。

圖8 GhBFT1-GFP融合蛋白在本氏煙草葉表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析Fig.8 Subcellular location of GhBFT1-GFP fusionprotein in leaf epidermal cells in N.benthamiana

3 討論

本研究從陸地棉新陸早33中克隆的GhBFT1基因，比對(duì)分析表明屬于D亞基因組，氨基酸分析表明二者都具有PEBP家族中區(qū)分FT和TFL1蛋白家族的保守氨基酸His88/Asp144。GhBFT1基因具有PEBP家族中的保守結(jié)構(gòu)，同樣具有保守的蛋白序列。GhBFT基因與一些物種中的CEN基因進(jìn)化距離接近，說(shuō)明了棉花TFL1旁系同源基因進(jìn)化中的多樣性。進(jìn)化分析表明很多物種中含有多個(gè)FT/TFL1旁系同源基因，如大豆的FT/TFL1基因家族，并且FT亞家族基本聚成一類(lèi)，而TFL1會(huì)聚類(lèi)成多個(gè)分支，說(shuō)明TFL1-like進(jìn)化上更為自由。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，棉花TFL1-like亞家族基因具有更豐富的進(jìn)化潛力。

蛋白亞細(xì)胞定位分析表明GhBFT1同其它植物的PEBP蛋白一樣位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。很多植物的PEBP同源蛋白都定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，如擬南芥的FT[15]、煙草的4個(gè)FT蛋白[16]、菊花CsTFL1[17]。很多研究表明，F(xiàn)T/TFL1都能與轉(zhuǎn)錄因子FD蛋白互作，促進(jìn)或抑制下游控制花分生組織活性基因的表達(dá)，從而促進(jìn)或抑制成花轉(zhuǎn)變。

基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)陸地棉GhBFT1基因在根、雄蕊中的表達(dá)量較高，在葉、花萼中表達(dá)量中等，在莖、花瓣中表達(dá)量較少，表明基因可能在不同組織中的表達(dá)模式不同。此外基因在胚珠和纖維發(fā)育的不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析表明，開(kāi)花前3天基因開(kāi)始表達(dá)，在開(kāi)花當(dāng)天和花后第1天的胚珠中表達(dá)水平最高，且呈現(xiàn)開(kāi)花后逐步降低的水平表現(xiàn)，而在開(kāi)花3天后都處于較低的表達(dá)水平，說(shuō)明基因可能在根和雄蕊的發(fā)育、胚珠發(fā)育的起始階段具有重要作用。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的BFT基因在地上部分的分生組織如蓮座葉、莖生葉及花中表達(dá)較高，在地下部分如根和再生頂端中表達(dá)較低。BFT基因所在的PEBP家族基因可以調(diào)控開(kāi)花轉(zhuǎn)變，能促進(jìn)開(kāi)花或抑制開(kāi)花，推測(cè)GhBFT1也可以參與調(diào)控開(kāi)花相關(guān)的代謝通路。此外，GhBFT1基因是否具有晝夜節(jié)律表達(dá)、是否參與調(diào)控纖維的發(fā)育、其詳細(xì)的功能及生物機(jī)理等方面都需要進(jìn)一步深入研究。