廖祥萍　張子良　劉琛俐 王懷偉　劉南海

【摘 要】目的：觀察白芍總苷對(duì)血管性癡呆（VD）大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制研究。方法 大鼠分假手術(shù)、VD模型、白芍總苷3組，每組10只。采用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，蛋白印跡分析測(cè)定各組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果：白芍總苷組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P<0.01），且海馬組織中Bcl-2顯著上調(diào)，Bax、Caspase-3表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。結(jié)論：白芍總苷可改善VD大鼠行為學(xué)能力，可能與其調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】白芍總苷;血管性癡呆;細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)： R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2019）13-0186-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.13.088

血管性癡呆（vascular dementia， VD）主要由腦血管長(zhǎng)期低灌注或反復(fù)缺血再灌注如大、小動(dòng)脈腦梗塞等引起的癡呆。據(jù)報(bào)道，預(yù)計(jì)到2030年，受癡呆影響的人數(shù)將增加到7000萬(wàn)，到2050年將為1.154億[1]。白芍總苷是從白芍中提取的有效成分，具有抗炎、抗氧化等藥理功效[2]，對(duì)腦缺血損傷所致大腦皮層、海馬、紋狀體等部位的病理改變具有保護(hù)作用[3]。本研究通過(guò)觀察白芍總苷對(duì)VD大鼠模型認(rèn)知功能及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，為治療VD提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

將SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為3組（n=10/組）：假手術(shù)組、模型組、白芍總苷組（150mg/kg）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

白芍總苷（寧波立華制藥有限公司）;兔抗Bcl-2、Bax、Caspase-3單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（Abcam公司）;Morris水迷宮（型號(hào)：EthoVision XT，北京諾達(dá)思信息技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.3 VD模型制備

10%水合氯醛腹腔麻醉，中線切口以暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈并分離，血管遠(yuǎn)端及近端采用0號(hào)手術(shù)線結(jié)扎。假手術(shù)組大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎，其余操作相同[4]。造模成功后第2天，藥物組灌胃給予相應(yīng)劑量白芍總苷，每日1次，連續(xù)8周，模型組與假手術(shù)組大鼠在相同時(shí)間給予等量生理鹽水。

1.4 大鼠行為學(xué)能力測(cè)試

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為兩階段：（1）定位航行試驗(yàn)：第1～4天，將大鼠面向墻壁依次放入四個(gè)象限的水中，檢測(cè)大鼠在120 s內(nèi)尋找平臺(tái)并在平臺(tái)停留10 s，即逃避潛伏期。（2）空間探索試驗(yàn)：第5天，移除平臺(tái)，大鼠自由游動(dòng)120s，記錄跨越平臺(tái)次數(shù)，考察大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶。

1.5 蛋白印跡分析Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)

取海馬組織加入勻漿緩沖液，冰上操作，勻漿后離心（10000g，4℃，15min），上清分裝，-80℃?zhèn)溆?BCA法測(cè)定蛋白濃度，10～12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂乳室溫封閉1h，一抗4℃過(guò)夜，二抗室溫2h，常規(guī)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，采用Image lab軟件測(cè)定條帶的灰度值并分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)能力的檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)（P<0.01），跨越平臺(tái)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組相比，白芍總苷治療組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.2 海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，Bax、Caspase-3表達(dá)水平顯著增加（P<0.01）。與模型組相比，白芍總苷治療組Bcl-2表達(dá)水平顯著升高，Bax、Caspase-3表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。

3 討論

VD作為一類可防治的癡呆，其危險(xiǎn)因素、發(fā)病機(jī)制及早期干預(yù)已成為研究熱點(diǎn)。然而，目前治療VD療效卓越的藥物仍十分稀少。白芍總苷是白芍中的提取物，對(duì)心腦血管疾病的干預(yù)也具有一定的優(yōu)勢(shì)[5-6]。因此，本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎制備的動(dòng)物模型以研究白芍總苷對(duì)VD大鼠模型行為學(xué)的影響及機(jī)制。

慢性低灌注誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡等多種復(fù)雜交織的生物學(xué)反應(yīng)。其中細(xì)胞凋亡在VD神經(jīng)元損傷機(jī)制中至關(guān)重要，并受Bcl-2、Bax等多種基因嚴(yán)格調(diào)控[7]。另外，Caspase-3作為凋亡執(zhí)行者，其激活也是VD中引發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)過(guò)程的關(guān)鍵介質(zhì)。研究證實(shí)，Bcl-2在調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，其過(guò)表達(dá)可減少細(xì)胞毒性損傷。相比之下，Bax作為促凋亡蛋白，可通過(guò)易位到線粒體膜，并促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放，從而傳導(dǎo)下游細(xì)胞凋亡事件[8]。鄭亞萍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，減輕心肌缺血再灌注損傷。另外，李世舉等[10]研究報(bào)道，白芍總苷促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細(xì)胞凋亡的作用也與其調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax有關(guān)。在本研究中，白芍總苷組大鼠的逃避潛伏期縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P<0.01），這表明白芍總苷可改善VD大鼠認(rèn)知障礙。同時(shí)，模型組大鼠海馬中Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，Bax、Caspase-3表達(dá)水平顯著增加（P<0.01）。相比之下，白芍總苷組大鼠海馬中Bcl-2表達(dá)水平顯著升高，Bax、Caspase-3表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。

綜上所述，在本研究中證實(shí)白芍總苷能夠改善VD模型大鼠的記憶障礙，機(jī)制可能與調(diào)節(jié)VD模型中的Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)水平有關(guān)。研究結(jié)果證實(shí)了白芍總苷對(duì)VD的神經(jīng)保護(hù)作用，并為其成為治療VD潛在的藥物提供依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

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