張 麗,曾嘉程,王 夢,付 曉,陳繼光,上官新晨,3,尹忠平,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045;2.江西明湖農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,江西上饒 335100;3.江西省食品藥品監(jiān)督管理局,江西南昌 330045)

芡實(EuryaleFeroxSalisb.),睡蓮科(Nymphaeaceae.)芡屬,是一年生水生植物干燥成熟的種仁,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被歷版中國藥典所收載[1]。芡實又名雞頭果、雞頭蓮、雞頭苞等[2],有“水中人參”的美譽,是珍貴的藥食兩用材料。在國外主要分布于印度、韓國、日本、東南亞、俄羅斯;在國內(nèi)主要種植于江蘇、山東、湖南、湖北、安徽、江西等省,有“刺芡”(北芡)與“蘇芡”(南芡)之分。芡實味甘、澀,性平,常用于養(yǎng)血安神、益腎固精、健脾、除濕、止帶、遺尿尿頻[3-4],是重要的經(jīng)濟作物,在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中已有數(shù)百年的歷史[5]。

芡實含有豐富的營養(yǎng)成分,在印度等國家,芡實是當(dāng)?shù)氐闹饕魑颷6-8];芡實主要含碳水化合物和蛋白質(zhì)[9],根據(jù)張氽等[10]的檢測結(jié)果,安徽產(chǎn)芡實中的淀粉含量為72.27%,粗蛋白為9.72%;除此之外,還具有多種功效成分,包括黃酮類、環(huán)肽類、甾醇類、脂類、腦苷脂類等[11-12]。土壤、氣候、溫度、光照等環(huán)境的不同,而導(dǎo)致藥材品質(zhì)上的差異[6],品種和產(chǎn)地的不同可導(dǎo)致芡實的營養(yǎng)成分和活性成分上的較大差異[13-15]。因產(chǎn)地氣候和環(huán)境上的不同,加上品種上的差異,芡實外觀質(zhì)量、經(jīng)濟性狀和營養(yǎng)成分等指標存在差異,一般的鑒別方法難以分辨其品質(zhì)的優(yōu)劣。目前,有文獻研究了不同產(chǎn)地芡實中無機元素的含量、建立芡實的HPLC指紋圖譜來評價不同產(chǎn)地芡實的質(zhì)量品質(zhì)[16-17];芡實作為一種富含營養(yǎng)的藥食兩用的材料,用于藥膳保健及產(chǎn)品開發(fā)的原料,至今尚無系統(tǒng)、明確的指標和方法來綜合評價芡實的品質(zhì)。本文對芡實的外觀、營養(yǎng)成分、活性成分進行了系統(tǒng)、全面的檢測,采用主成分分析(PCA)和聚類判別方法(CA)來對不同產(chǎn)地芡實進行模式識別研究,為芡實品質(zhì)的科學(xué)評價和芡實資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

13個樣品分別產(chǎn)于江蘇、安徽、江西等6省13地市的芡實栽培區(qū)或種植基地(2016年10月中旬采收),樣品信息如表1所示；乙腈 色譜純,美國Tieda試劑有限公司;乙醇、冰乙酸,冰乙酸 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;硝酸 優(yōu)級純,南京化學(xué)試劑有限公司;Mn單元素標準溶液(10 μg/mL)、混合標準品溶液(含K、Fe、Al、Mg、Ca、P、Zn) 1000 μg/mL,國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

表1 13個芡實樣品的來源和編號

Agilent1260型高效液相色譜儀 美國Agilent科技有限公司;ETHOS型微波消解系統(tǒng) 意大利MILESTONE公司;Agilent 5100 VDV ICP-OES 美國Agilent科技有限公司;色差儀ColorQuest XE 美國HunterLab;超純水制備儀 美國Millipore公司;中草藥粉碎機 永康市艾澤拉電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芡實外觀質(zhì)量和特性的描述和檢測 參考王中奎等[18]的方法,略作修改,分別描述帶殼芡實形狀、殼面光滑程度、核仁飽滿情況;用游標卡尺測量帶殼芡實的縱徑、橫徑、果殼厚度,描述果殼的特性,計算堅果的果形指數(shù)(果實縱徑與橫徑的比值);測定帶殼芡實的百果質(zhì)量和去殼百種仁質(zhì)量,計算果仁出仁率(去殼核仁質(zhì)量占果實總質(zhì)量的百分率);以色差儀測定芡實外殼顏色的L*、a*、b*值,L*代表亮度,范圍在0～100之間,L*值越高表明樣品表面越白;a*代表紅度,b*代表黃度。

1.2.2 樣品預(yù)處理 采用專用的鷹嘴鉗,將來自于江蘇、安徽、江西等13個芡實栽培區(qū)或種植基地的帶殼芡實進行手工去殼,得到芡實殼和芡實種仁;用粉碎機將13個芡實種仁樣本進行粉碎,過80目篩,即得到芡實粉末,分別裝入自封袋中備用,以用來測定下述指標。

1.2.3 芡實主要營養(yǎng)成分的測定 水分含量的測定:直接干燥法,按照GB 5009.3-2016執(zhí)行;灰分含量的測定:按照GB 5009.4-2016執(zhí)行;脂肪含量的測定:索氏抽提法,按照GB 5009.6-2016執(zhí)行;膳食纖維含量的測定:按照GB 5009.88-2014執(zhí)行;粗蛋白含量測定:半微量凱氏定氮法,按照GB 5009.5-2016執(zhí)行;淀粉含量的測定:酸水解法,按照GB 5009.9-2016執(zhí)行。

1.2.4 芡實醇提物的HPLC測定方法 參照陳蓉等[16]的方法,略作修改。樣品制備:稱取5 g芡實粉末,加入50 mL 80%乙醇超聲提取30 min,4000 r/min離心5 min后取上清液濃縮,用2 mL 80%乙醇溶解后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

色譜柱為Agilent Eclipse C18色譜柱(4.6 mm×250 mm;5 μm);流動相為乙腈(A)及1%醋酸水溶液(B)進行梯度洗脫;流速為1 mL/min;進樣量為10 μL;檢測波長:273 nm;柱溫30 ℃,洗脫程序:流動相:乙腈(A)及1%醋酸水溶液(B);梯度洗脫:0～5 min,98% B,5～10 min,98%～92% B,10～12 min,92%～90% B,12～32 min,90%～87% B,32～50 min,87%～60% B,50～60 min,60%～30% B,60～65 min,30%～98% B。

1.2.5 芡實金屬元素含量的測定 參考王紅等[17]的方法,主要檢測步驟如下:分別精密移取混合標準溶液(含K、Fe、Al、Mg、Ca、P、Zn)0、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25 mL,用5%的濃硝酸定容至50 mL,配成質(zhì)量濃度分別為0、2、5、10、15、20、25 mg/L系列的混合對照品溶液;分別精密移取Mn標準溶液0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1 mL,用5%的濃硝酸定容至50 mL,配成含質(zhì)量濃度分別為0、2、5、10、20、25、100、200 μg/L系列混合對照品溶液。

精密稱取芡實粉末0.2～1 g樣品放入聚四氟乙烯消解罐中,精確加入5 mL濃硝酸,置于通風(fēng)櫥中靜置20 min,待反應(yīng)不劇烈后加蓋密封,裝入微波消解儀中,從25 ℃升至220 ℃,維持220 ℃消解20 min后,冷卻至室溫,取出,在通風(fēng)櫥中揮盡余酸,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用去離子水定容至刻度線,搖勻,即得待測樣液。除未加樣品,其他步驟相同,作為空白對照。

ICP-OES工作條件:等離子體射頻功率1.20 kW,等離子氣流量12 L/min,霧化器流量0.70 L/min,輔助氣流量1.0 L/min;泵速12 r/min,讀取時間5 s,穩(wěn)定時間15 s,觀察方向徑向,觀察高度8 mm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究使用的統(tǒng)計分析軟件為R-3.3.1。使用LSD.test()函數(shù)進行組間差異分析;先使用scale()函數(shù)對數(shù)據(jù)進行標準化處理,再采用principal()函數(shù)、hclust()函數(shù)分別進行主成分和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地芡實的外觀特征

圖1a是來自于江蘇、安徽、江西等6個省13個芡實栽培區(qū)或種植基地的帶殼芡實,圖1b和圖1c是手工去殼后分別得到的芡實殼和芡實種仁。從圖1可以直觀的看出,不同產(chǎn)地的芡實在顆粒大小、形狀、色澤和果殼厚度等存在差異,B(安徽省合肥市)產(chǎn)地蘇芡顆粒較大,產(chǎn)地L(江西省上饒市)較小;殼的厚度和種仁的大小基本上與帶殼顆粒的大小成正比,大顆粒的芡實一般來說殼較厚、種仁較大;種仁粒徑的差異沒有帶殼顆粒粒徑的差異那么大。由表2可知,不同產(chǎn)地芡實在果形、外殼光滑度、取仁難易度、種仁飽滿度方面也存在較大的差異;外形上有橢圓或長圓形兩種形狀,蘇芡表面較刺芡表面光滑;從外觀色澤上來看,不同產(chǎn)地芡實的顏色差異很大,L*值介于52.65～30.03 之間,產(chǎn)地D(江蘇省揚州市)的芡實的亮度最大,產(chǎn)地F的芡實的亮度最低;a*值范圍為13.75～1.51,均為正值,產(chǎn)地D的芡實的a*(13.75)顯著高于其他各產(chǎn)地;不同產(chǎn)地芡實的b*值均為正,其中D產(chǎn)地的芡實b*值最大(25.99),L產(chǎn)地的芡實的b*值(3.81)最小?？偟膩碚f,蘇芡顆粒較大,外種皮厚,表面光滑,棕黃色或棕褐色,種仁圓整;刺芡顆粒近圓形,較小[19]。

圖1 來源于13個產(chǎn)地的芡實全果、果殼和種仁照片

表2 來源于13個產(chǎn)地的芡實的外觀形態(tài)特征

芡實的經(jīng)濟價值取決于其外形、果殼厚度、種仁大小和出仁率等。由表3可知,不同產(chǎn)地的芡實經(jīng)濟價值指標差異較大。從果形指數(shù)來看,蘇芡在外形上偏圓,刺芡偏橢圓和長圓,其中江蘇省蘇州市產(chǎn)地(編號C)的蘇芡的芡實果形指數(shù)最小(0.90),果形偏圓,外形圓潤、美觀,與其相近的是產(chǎn)地A、D和B的芡實,平均果形指數(shù)分別為0.91、0.92和0.93;而產(chǎn)地L的芡實平均果形指數(shù)最大(1.11),果形呈長圓形,外形較差。芡實百果質(zhì)量、果仁質(zhì)量、出仁率是主要經(jīng)濟性狀指標,直接關(guān)系到芡實的經(jīng)濟價值。由表3中可看出,不同產(chǎn)地芡實的百粒質(zhì)量的差別較大,其中B產(chǎn)地的芡實在百果質(zhì)量(128.55 g)和百果仁質(zhì)量(60.51 g)兩方面都顯著高于其他產(chǎn)地(p<0.05),分別是L產(chǎn)地芡實百果質(zhì)量(36.66 g)的3.51倍和百果仁質(zhì)量(24.35 g)的2.49倍。果殼厚度指標能衡量取仁的難易程度,也影響出仁率,蘇芡(產(chǎn)地A、B、C、D)的果殼都顯著(p<0.5)厚于刺芡,其果殼厚、多孔、不緊實;而刺芡則與之相反,易于去殼,如B產(chǎn)地芡實的果殼厚度(3.58 mm)達到M產(chǎn)地芡實的(0.98 mm)3.65倍,這也導(dǎo)致了蘇芡的出仁率低于刺芡,如產(chǎn)地M芡實的出仁率(68.80%)最高,產(chǎn)地C芡實的出仁率(44.71%)最低。

表3 不同產(chǎn)地芡實的經(jīng)濟性狀指標比較

2.2 不同產(chǎn)地芡實種仁的主要成分

營養(yǎng)成分含量是芡實品質(zhì)的重要指標,從表4中可看出,不同產(chǎn)地芡實營養(yǎng)成分指標有明顯差異。芡實中含有最多的營養(yǎng)成分是碳水化合物,13份樣品中以D產(chǎn)地芡實的淀粉含量百分比最大,為76.84%,其次是產(chǎn)地L的芡實(76.53%),產(chǎn)地F的芡實淀粉含量最低,為69.68%,與最大值相差7.16%。芡實營養(yǎng)成分中居第二位的是蛋白質(zhì),由表4可看出,產(chǎn)地A的芡實蛋白質(zhì)含量最大,為13.61%,與產(chǎn)地M、E、F、H、J的差異不明顯;蛋白質(zhì)含量最低的是D產(chǎn)地的芡實,僅為11.03%。膳食纖維含量最大的是產(chǎn)于F(4.24%)產(chǎn)地的芡實,其顯著(p<0.05)高于其他產(chǎn)地的芡實,是含量最低L產(chǎn)地芡實的1.61倍(2.64%)。芡實中含有少量的脂肪,多為不飽和的脂肪酸[11-12]。從表4中可看出,K產(chǎn)地芡實的脂肪含量百分比最大,為0.66%,顯著高于其他產(chǎn)地,是產(chǎn)地G芡實的2.75倍(G產(chǎn)地的芡實脂肪含量僅為0.24%)。

表4 不同產(chǎn)地芡實主要營養(yǎng)成分的含量(%)

2.3 不同產(chǎn)地芡實醇提物的HPLC檢測與分析

不同的生長環(huán)境、土壤性質(zhì)等會導(dǎo)致藥材具有不同含量的功效成分,從而導(dǎo)致不同的藥效,通常可采用液相來測定這些功效成分,據(jù)此評價藥材的品質(zhì)[20]。本文中采用高效液相色譜(HPLC)法,檢測了13個不同產(chǎn)地芡實樣品乙醇提取物中的主要成分,據(jù)此建立了芡實的指紋圖譜(圖2b)。從HPLC檢測譜圖(圖2a)可知,13批芡實樣品有12個共有峰,峰2、3、8是芡實乙醇提取物中最主要的組分。

圖2 芡實樣品的HPLC檢測圖譜(a)和其余13批芡實樣品的HPLC檢測疊加圖譜(b);

采用國家藥典委員會頒發(fā)的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A》對不同產(chǎn)地芡實進行質(zhì)量評價。由指紋圖譜的結(jié)果可知,保留時間的RSD均小于0.68%,表明方法穩(wěn)定可靠,符合指紋圖譜技術(shù)要求;但峰面積的RSD(23.69%～102.55%)變化較大;產(chǎn)地A～M的特征圖譜的相似度值分別為0.92、0.94、0.94、0.95、0.90、0.93、0.93、0.84、0.90、0.96、0.96、0.93、0.96、0.90,說明化學(xué)組成較一致。

結(jié)合表5可知,其中產(chǎn)地D(江蘇省揚州市)蘇芡的總峰面積(13316.05)最大,是產(chǎn)地L刺芡的總峰面積(5592.61)的2.38倍;其中主要的組分是峰2、3、8,產(chǎn)地D的峰2的面積(3629.46)最大,產(chǎn)地A的峰2的面積(871.98)最小;產(chǎn)地I的峰3的面積(2257.01)最大,產(chǎn)地L的峰3的面積(990.42)最小;產(chǎn)地H的峰8的面積(2871.44)最大,產(chǎn)地L的峰8的面積(341.03)最小。不同產(chǎn)地的芡實在各峰的峰面積上存在不同程度的差異,但大部分樣品的譜圖總體上相似,共性特征基本相同,說明不同產(chǎn)地芡實的成分組成基本上是一致的,但在成分含量上存在差異,其原因可能與產(chǎn)地氣候、水土、加工方法等因素有關(guān)。但本文所選出的共有成分未知,需要結(jié)合質(zhì)譜等手段進一步確定。

表5 不同產(chǎn)地芡實樣品的HPLC檢測結(jié)果

2.4 不同產(chǎn)地芡實無機元素含量的測定結(jié)果與分析

不同產(chǎn)地的地理、氣候、土壤等因素會影響植物的無機成分含量[21],無機元素與蛋白質(zhì)、肽、脂類、多糖、核酸等生物分子密切相關(guān),并調(diào)控生理功能的關(guān)鍵步驟,從而影響中藥材的藥效和品質(zhì)[22-23]。本文采用ICP-OES法對不同產(chǎn)地芡實的無機元素(Mn、K、Fe、Na、Mg、Ca、P、Zn)進行了系統(tǒng)地測定,標準曲線方程如表6，結(jié)果如表7所示。由表7可知,芡實中含較豐富的大量元素(Na、Mg、P、K和Ca),其中含量最高的是元素P,可高達1590.67 μg/g,微量元素Mn、Fe和Zn的含量也較為豐富,含量最高可分別達到25.53、17.84和38.39 μg/g。從本文測定的元素來看,產(chǎn)地E(安徽省天長市)的刺芡中元素K(1458.90 μg/g)、Mg(348.95 μg/g)、P(1590.67 μg/g)、Zn(38.39 μg/g)的含量均高于其他產(chǎn)地,但元素Ca(90.79 μg/g)、Mn(15.99 μg/g)的含量低于其他產(chǎn)地。

表6 標準曲線方程

表7 不同產(chǎn)地芡實中的無機元素檢測結(jié)果

2.5 主成分分析

主成分分析法是將多個變量通過線性變換,降維,選出較少個數(shù)的代表性變量進行綜合分析和評價的方法[24]。本文通過主成分分析分法將23個指標降維成6個主成分,得到芡實主成分因子負荷矩陣(見表8),前6個主成分累積方差貢獻率達到91.20%,盡可能反映了原變量的信息。其中,對PC1(第1主成分)影響的主要指標為a*、b*、果形指數(shù)、百果質(zhì)量、果殼厚度、出仁率、脂肪、Na、P、Zn;對PC2(第2主成分)影響的主要指標為L*、百果仁質(zhì)量、總峰面積、Mn、Ca、K;對PC3(第3主成分)影響的主要指標為水分、蛋白質(zhì)、淀粉;對PC4(第4主成分)影響的主要指標為灰分、Fe;對PC5(第5主成分)影響的主要指標為Mg;對PC6(第6主成分)的影響主要指標為膳食纖維。

表8 主成分因子載荷矩陣

依據(jù)相關(guān)矩陣累計方差貢獻率提取的6個主成分為綜合評價指標,得到了不同產(chǎn)地芡實的綜合評分(F)及得分排名(見表9)。蘇芡的綜合排名靠前,刺芡的排名靠后,就本實驗測定的23個指標和本文的計算方式而言,蘇芡和刺芡的不論從外觀還是組分含量上與刺芡存在明顯差異。這與吳仰風(fēng)[19]的研究結(jié)果相同,蘇芡(南芡)植株個體較大,種仁圓整,糯性,煮食不易碎裂,品質(zhì)優(yōu)良;刺芡(北芡)植株個體和器官均較小,種子和種仁近圓形,較小,欠整齊,粳性,品質(zhì)中等。

表9 不同產(chǎn)地芡實的主成分得分及綜合排序

2.6 不同產(chǎn)地芡實的聚類分析

以系統(tǒng)聚類分析對不同產(chǎn)地芡實的各項指標進行系統(tǒng)聚類,據(jù)此來研究13個芡實樣品的關(guān)系,結(jié)果如圖3。從聚類樹形圖可以看出,可將2個品種13個不同產(chǎn)地的芡實分為兩類:第Ⅰ類聚集產(chǎn)地A(江蘇省淮安市洪澤區(qū))、B(安徽省合肥市廬江縣)、C(江蘇省蘇州市)、D(江蘇省揚州市寶應(yīng)縣)的芡實;第Ⅱ類聚集了其他產(chǎn)地的刺芡,與主成分分析的結(jié)果基本類似,這兩種分析方法可以相互驗證。本文前述數(shù)據(jù)也顯示,蘇芡個體較大,種仁圓整,在果形指數(shù)、果質(zhì)量、果殼厚度方面與其他產(chǎn)地的刺芡存在顯著差異(p<0.05)。隨著閾值的減小,第Ⅱ類又可分為2小類,相同產(chǎn)地的樣品多被聚在一個小類之中;產(chǎn)地L和E的刺芡聚為一小類,這兩個產(chǎn)地的刺芡成分較為相近,在果殼厚度、百果仁質(zhì)量、出仁率和脂肪、膳食纖維的含量相近,在p<0.05水平上無顯著差異,這也從另一角度說明了本文聚類結(jié)果的合理性和可靠性。來自江蘇省、廣東省、山東省、江西省、河南省5個產(chǎn)地的刺芡聚為另一小類群。產(chǎn)地對芡實果實的品質(zhì)有一定的影響,但相比品種而言,影響相對較小,在采摘時應(yīng)盡量按品種分批采收,不同產(chǎn)地相同品種采后盡量不混放,避免加工原料不統(tǒng)一。

圖3 不同產(chǎn)地芡實聚類分析圖

3 結(jié)論

本文從外觀、主要營養(yǎng)成分、活性成分、微量元素四個方面對產(chǎn)自于江蘇、安徽、江西等13個不同栽培區(qū)或種植基地的芡實品質(zhì)進行了綜合評價,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的芡實在外觀上差異明顯,蘇芡個體較大,種仁圓整,殼厚,出仁率低;刺芡個體較小,種仁近圓形,殼薄,出仁率高。不同產(chǎn)地的芡實在淀粉、粗蛋白、脂肪、微量元素等主要成分含量上的差異也非常顯著(p<0.05)。高效液相色譜共有圖譜分析顯示樣品間的相似度為0.84,說明化學(xué)組成較一致,但在成分含量上存在差異。這些指標表明各個產(chǎn)地芡實各具特色,各有所長,單一或幾個指標難以表征芡實的真實品質(zhì)。通過主成分分析,可將23個評價指標綜合為6個主成分,6個主成分反映了原變量91.20%的信息,可為芡實品質(zhì)評價提供參考。通過聚類分析,可將13個產(chǎn)地的芡實聚為蘇芡和刺芡兩大類,表明芡實品質(zhì)受品種影響較大,產(chǎn)地對芡實的品質(zhì)有一定的影響,但相比品種而言,影響相對較小。