范文廣,杜娜娜,牛曉倩,任海偉,連小峰,彭 程,王永剛,曹瑩瑩

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

百合(Liliumbrowniivar.viridulum Baker)是一種可用于飲食或做藥材使用的百合科百合屬(Lilium)球根類植物,多種營養(yǎng)成分和活性物質(zhì),如維生素、多糖和生物堿等,具有補(bǔ)脾健胃、潤肺清火安神等功效[1]。百合脂肪含量低,可在食品行業(yè)中作為開發(fā)低脂原材料,加以利用,是我國衛(wèi)生部審批通過的首批藥食兼用資源,具有很高的市場價值。鮮切百合鱗莖片新鮮、便利,越來越受到國內(nèi)外消費(fèi)者的喜歡,但鮮切改變百合鱗莖片的組織代謝,影響其生理生化變化,如乙烯生成增加和營養(yǎng)流失,因此鮮切后需經(jīng)一定的處理。百合鱗莖片中含有大量的酚類化合物和多種酶(多酚氧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶),鮮切或輕微加工處理打破酚類和酶的區(qū)域化,容易引起百合鱗莖片的褐變,同時也會增加細(xì)菌和真菌病害,導(dǎo)致商品價值下降[2],所以抑制百合鱗莖片褐變,延長貯藏期顯得尤為重要。

果蔬常見的保鮮方法有物理保鮮、化學(xué)保鮮、生物保鮮,其中物理方法包括冷藏、熱處理、氣調(diào)、電子輻射、脈沖、紫外以及低溫等離子體,并且有些方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于百合鱗莖片的貯藏和保鮮[3-4]。雖然物理保鮮技術(shù)應(yīng)用較廣,但其設(shè)備復(fù)雜、投資要求較高,基于此,許多化學(xué)方法也應(yīng)用于百合鱗莖片的貯藏和保鮮[5-6]。雖然化學(xué)方法在一定程度上能夠減輕百合鱗莖片在貯藏和加工過程中的褐變和質(zhì)量損失,但是化學(xué)物質(zhì)的殘留以及對環(huán)境的污染是不容忽視的。在這種情況下,尋求可以替代化學(xué)防腐劑的抑菌譜廣、安全性高的天然抗菌劑成為一個重要的研究目標(biāo)。

天然抗菌劑按照來源的不同可分為三類:植物源抗菌劑、動物源抗菌劑及微生物源抗菌劑[7]。其中,微生物防腐劑是用發(fā)酵等技術(shù)處理自然界中的農(nóng)產(chǎn)品獲得,對人體沒有毒害,應(yīng)用范圍廣,并且十分穩(wěn)定,漸漸成為食品防腐保鮮研究的熱點(diǎn)之一。已從微生物中得到的天然防腐劑有細(xì)菌素類的乳酸菌素和小菌素、放線菌類的納他霉素、霉菌類的米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的曲酸以及某些酵母菌、真菌、食用菌和聚賴氨酸等。其中由米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的曲酸,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品的保鮮,曲酸具有很好的抑制果蔬褐變和抑菌效果,比如應(yīng)用在防止蘋果汁褐變,鮮切馬鈴薯、山藥、蓮藕及荔枝的保鮮[8-11],目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)曲酸應(yīng)用于百合鱗莖片的保鮮。曲酸難附著在百合鱗莖片的表面,基于此,利用海藻酸鈉良好的成膜性,將二者結(jié)合起來,制備形成曲酸-海藻酸鈉復(fù)合膜。本研究以百合鱗莖片為試材,采用正交試驗篩選曲酸-海藻酸鈉(kojic acid/sodium alginate)復(fù)合膜配方,并將其應(yīng)用于百合鱗莖片保鮮,尋找一種抑制百合鱗莖片在貯藏和加工中褐變的方法,以期為百合貯藏保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor) 采挖自蘭州市七里河區(qū)西果園鄉(xiāng),挑選形狀基本一致,無病蟲害和明顯機(jī)械損傷的新鮮百合鱗莖,將百合鱗莖片分為外、中、內(nèi)三部分,外層即從外向內(nèi)數(shù)1～3層,內(nèi)層即由內(nèi)向外數(shù)1～3層,其余為中層,本次試驗采用中層百合鱗莖片;PVC復(fù)合保鮮袋 長×寬=250×210 mm,厚度為0.03 mm;曲酸 阿拉丁試劑有限公司;海藻酸鈉 上海麥克林生化科技有限公司;甘油 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

LF-600R冷凍離心機(jī) 上海江東儀器有限公司;UV2600-A型紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司;恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;Model CR-300色差計 日本Minolta;Mulitest 2.5-i質(zhì)構(gòu)儀 美國Mecmesin Co.,。

1.2 實驗方法

1.2.1 曲酸-海藻酸鈉復(fù)合膜的制備及處理

1.2.1.1 單因素實驗 選取海藻酸鈉、曲酸、甘油3種單一試劑分別對百合鱗莖片進(jìn)行實驗,其使用濃度見表1。將百合鱗莖片置于不同濃度溶液中浸泡2 min,室溫放置,撈出,自然瀝干,用蒸餾水浸泡百合鱗莖片作為對照,用聚氯乙烯(PVC)保鮮袋包裝后放置在4 ℃、相對濕度(90%)下貯藏15 d,每組處理30片,用顏色綜合指數(shù)E來評價。

表1 3種保鮮劑及用量

1.2.1.2 復(fù)合膜組合篩選 在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上,進(jìn)行3因素3水平L9(34)正交試驗,百合鱗莖片涂膜處理后用保鮮袋包裝,置于4 ℃冷庫貯藏15 d,相對濕度為90%～95%,所有處理均重復(fù)3次。用百合鱗莖片表面顏色綜合指數(shù)E去評價保鮮效果。

表2 正交因素水平表

1.2.1.3 復(fù)合膜制備 根據(jù)正交試驗結(jié)果,制備復(fù)合膜(見2.2)。制作過程如下:海藻酸鈉加水溶解成溶膠狀,將曲酸、甘油依次加入到之前混合均勻的海藻酸鈉溶液中,將其攪拌均勻后加水補(bǔ)足至相應(yīng)體積,備用。將攪拌均勻的涂膜復(fù)合液進(jìn)行20 min的超聲處理[12]。

1.2.1.4 百合鱗莖處理 實驗分為兩組,即對照組CK(百合鱗莖片浸泡在蒸餾水浸泡2 min)和處理組B(百合鱗莖片浸泡在最佳曲酸-海藻酸鈉復(fù)合膜溶液中2 min),處理完成后放于黑布上自然晾干,然后裝入聚氯乙烯(PVC)保鮮袋中,在冷庫中貯藏(冷庫溫度為4 ℃,相對濕度為90%～95%),每3 d取一次樣,每次取3袋。測定樣品相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.2 硬度測定 使用質(zhì)構(gòu)儀測定,探頭為TA70,力量感應(yīng)元500 N,形變量30%,檢測速度60 mm/min,探頭壓縮樣品的距離為5 mm,起始力0.5 N,放置樣品時間5 s。

1.2.2.3 PPO和POD活性的測定 PPO活性的測定參照Meng等[13]方法并修改。2.0 g樣品與10 mL磷酸鹽緩沖液(預(yù)冷、濃度為0.1 mol/L、pH為6.4、含5%聚乙烯吡咯烷酮(PVPP))混合并充分研磨成漿。將勻漿在4 ℃條件下,15000×g離心30 min,上清液即為粗酶液。PPO反應(yīng)體系為0.2 mL上清液和3 mL磷酸緩沖液(濃度為0.1 mol/L、pH為6.4、含有0.5 mol/L鄰苯二酚)。在398 nm下測量吸光度值,記錄第一個25 s的反應(yīng)。每分鐘吸光度變化0.01的酶的量為一個酶活性單位,表示為U·g-1。

POD活性的測定參照Wang等[14]方法進(jìn)行。將2.0 g樣品與10 mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0.05 mol/L、pH為7.8)放入研缽中研磨。離心條件設(shè)置為4 ℃,15000×g離心30 min,勻漿離心后備用。反應(yīng)體系中含有0.1 mL上清液和2 mL 0.05 mol/L含有0.04 mol/L愈創(chuàng)木酚的磷酸緩沖液(pH7.8)。在加入0.1 mL H2O2(0.02 mol/L)后,在398 nm下測量吸光度值測定該體系的吸光度,記錄第一個30 s反應(yīng)。每分鐘吸光度變化0.01的酶的量為一個酶活性單位,表示為U·g-1。

1.2.2.4 PAL活性測定 PAL活性的測定根據(jù)Luo等[15]方法并修改。取1.0 g樣品置于研缽中,用10 mL硼酸鹽緩沖液(濃度為0.01 mol/L,pH為8.8,含有5%聚乙烯吡咯烷酮)充分研磨。勻漿后通過紗布過濾,濾液在4 ℃條件下,14000×g離心15 min,收集上清液用于測定PAL活性。反應(yīng)體系為:向試管中加入1 mL L-苯丙氨酸(0.02 mol/L),再加入4 mL硼酸鹽緩沖液(濃度為0.01 mol/L、pH為8.8),1 mL酶提取液和1 mL蒸餾水,混合均勻后,設(shè)置水浴鍋溫度為30 ℃,保溫60 min。保溫完成后,通過紫外可見分光光度計測定其在290 nm下的吸光度值。每分鐘吸光度變化0.01的酶的量為一個酶活性單位,表示為U·g-1。

1.2.2.5 總酚和醌類含量的測定 總酚和醌類含量的測定參考劉程慧等[16]方法并修改。取樣品3 g,加入20 mL甲醇,打漿勻質(zhì)后,紗布過濾,濾液經(jīng)15000×g,低溫離心15min。取上清液,倒入比色皿中,設(shè)置波長為320、437 nm,測定吸光值,分別表示總酚(OD320·g-1)和醌類(OD437·g-1)的含量。

1.2.2.6 丙二醛含量的測定 丙二醛含量的測定參考姜愛麗等[17]方法并修改。稱取0.5 g百合,先加入1 mL三氯乙酸溶液(10%)研磨,研磨后再加入4 mL三氯乙酸溶液(10%)充分研磨,離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為4000 r/min,離心10 min。取2 mL上清液,加入2 mL硫代硫酸鈉溶液(0.67%),將裝有混合溶液的玻璃容器放入沸水中,處理15 min。迅速使其冷卻后,在4000 r/min條件下離心10 min,在450、532、600 nm下取上清液分別測定其吸光值。MDA含量用μmol·g-1來表示。

1.2.2.7 微生物的測定 微生物的測定參考高翔等[18]方法并修改。微生物用可培養(yǎng)的菌落總數(shù)來評價。25 g百合鱗莖片分別切成小塊用225 mL氯化鈉緩沖溶液(0.85%)稀釋。勻漿2 min后,連續(xù)進(jìn)行稀釋,稀釋梯度分別為10-1～10-9。每個梯度處理都被倒在平板上進(jìn)行培養(yǎng),在37 ℃培養(yǎng)48 h后,選取菌落數(shù)在50～100之間的平板作為測定標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果用lg CFU·g-1來表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個指標(biāo)每次重復(fù)測定3次,取其平均值。采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Prism 6.0進(jìn)行繪圖。均值間比較采用Duncan’s多重比較,數(shù)據(jù)表示為Mean±SD。在0.05水平上進(jìn)行顯著性檢,*表示p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

由表3可以看出,保鮮劑處理組的顏色綜合指數(shù)E*優(yōu)于蒸餾水對照處理,海藻酸鈉處理組效果最好。海藻酸鈉濃度較高時,更利于保持百合鱗莖片的顏色,曲酸濃度對百合鱗莖片的顏色影響不大,甘油隨著濃度的增大,E增大,而甘油濃度達(dá)到0.4%時,E降低。綜合考慮選擇海藻酸鈉5、8、11 g/L,曲酸0.5、1.0、1.5 g/L,甘油0.1%、0.2%、0.3%進(jìn)行正交試驗,研究復(fù)合膜保鮮效果。

表3 單一試劑對百合鱗莖片表面顏色綜合指數(shù)的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

如表4所示,百合鱗莖片在4 ℃條件下貯藏15 d后,由R值可知,影響E*值的因素主次順序為A>C>B,最佳的組合為A2B2C3,是T5處理組,E值為83.95,海藻酸鈉、曲酸及甘油的濃度分別為8 g/L、1.0 g/L及0.3%為最佳復(fù)合膜配方。

表4 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 復(fù)合膜保鮮效果的方差分析

如表5所示,海藻酸鈉對E*值有顯著影響(p<0.05),而曲酸、甘油對E*值無顯著影響(p>0.05)。綜上,海藻酸鈉對百合鱗莖片的貯藏具有一定的保鮮效果,海藻酸鈉濃度升高可以在一定程度上提升E*值。

表5 方差分析表

2.4 硬度的變化

從圖1可以看出,貯藏過程中對照組與處理組百合鱗莖片的硬度都呈下降趨勢,而曲酸-海藻酸鈉涂膜液處理組百合鱗莖片的硬度在貯藏第6～15 d顯著(p<0.05)高于對照組。在貯藏期結(jié)束時(15 d),處理組百合鱗莖片的硬度高于對照組硬度約16.5%。說明曲酸-海藻酸鈉復(fù)合液涂膜處理可以延緩硬度下降,較好地維持百合鱗莖片硬度。

圖1 百合鱗莖片貯藏過程中硬度變化

2.5 百合鱗莖片表面顏色變化

由圖2可知,L*值變化整體呈下降趨勢,第6 d對照組的L*值開始明顯下降,而處理組下降緩慢,變化不大;a*值變化整體呈上升趨勢,對照組a*值在第3 d上升趨勢已經(jīng)顯著高于處理組(p<0.05),而處理組a*值增加不大。對照組b*值整體呈上升趨勢,處理組b*值呈下降趨勢;E*值整體呈現(xiàn)出下降趨勢,與L*值變化趨勢相似,第6 d對照組E*值明顯下降,而處理組下降緩慢。由圖2可以看出,隨貯藏時間的延長,百合鱗莖片色澤變暗、顏色加深,但處理組百合鱗莖片相較于對照組百合鱗莖片而言,變化程度較小。曲酸-海藻酸鈉涂膜處理可以延緩百合鱗莖片褐變反應(yīng),保持百合鱗莖片色澤。

圖2 曲酸-海藻酸鈉涂膜對百合鱗莖片貯藏過程中L*值、a*值、b*值、E值影響

圖3所示,第15 d時,對照組百合鱗莖片表面出現(xiàn)褐變、紅變,而處理組百合鱗莖片表面幾乎未出現(xiàn)褐變,表面顏色大部分保留了亮白色。曲酸-海藻酸鈉復(fù)合液涂膜處理很好地抑制了百合鱗莖片褐變。

圖3 曲酸-海藻酸鈉涂膜處理百合鱗莖片15 d時表面顏色

2.6 PPO、POD和PAL活性變化

兩組PPO活性在貯藏期間均有所提高,呈上升趨勢(圖4),這與鮮切茭白和洋薊貯藏過程中PPO活性變化一致[19-20],處理組百合鱗莖片的PPO活性一直低于對照組。在貯藏期結(jié)束時(15 d),處理組百合鱗莖片的PPO活性低于對照組大約23.5%。兩組POD活性趨勢呈先上升后下降的倒“V”字型趨勢(圖4),對照組PPO活性在第9 d達(dá)到最高峰,然后下降,而處理組PPO活性在12 d達(dá)到最高峰,表明曲酸-海藻酸鈉涂膜處理延遲了POD活性高峰出現(xiàn)時間。有許多相關(guān)研究POD活性變化出現(xiàn)先上升后下降趨勢,例如鮮切蘋果和蘑菇[21-22],但是POD活性高峰出現(xiàn)的時間有所不同,可能是因為實驗材料和處理方法不同引起。在貯藏時間內(nèi),處理組百合鱗莖片POD活性始終低于對照組。在貯藏期結(jié)束時(15 d),處理組POD活性比對照組低約17%。PAL活性整體呈先上升后下降的趨勢,在第9 d時PAL活性迅速增加,在第12 d到達(dá)頂峰后,然后下降,在鮮切富士蘋果[23]和胡蘿卜[24]研究中,PAL活性變化也呈現(xiàn)相同趨勢。曲酸-海藻酸鈉復(fù)合液涂膜處理百合鱗莖片PAL活性始終低于對照組。在貯藏期結(jié)束時(15 d),對照組百合鱗莖片PAL活性高于對照組23.6%。

圖4 曲酸-海藻酸鈉涂膜對百合鱗莖片貯藏過程中PPO、POD和PAL活性變化影響

2.7 酚類和醌類含量變化

在貯藏過程中,兩處理組百合鱗莖片總酚含量呈上升趨勢,曲酸-海藻酸鈉復(fù)合液處理抑制酚類化合物的積累,處理組總酚含量始終在對照組之下。貯藏期間,醌類含量呈整體上升趨勢,在第9 d時,對照組醌類含量迅速上升,處理組醌類上升速率較對照組小(p<0.05)。

圖5 曲酸-海藻酸鈉涂膜對百合鱗莖片貯藏過程中總酚、醌類含量變化的影響

2.8 MDA含量的變化

對照組與處理組的MDA含量隨著貯藏時間延長而增加(圖6)。在貯藏期內(nèi)(0～15 d),對照組百合鱗莖片MDA含量增加了163.3%。曲酸-海藻酸鈉涂膜處理抑制并延遲了MDA的積累,處理組百合鱗莖片MDA含量在第15 d時比對照組低22.7%。

圖6 曲酸-海藻酸鈉涂膜對百合鱗莖片貯藏過程中丙二醛含量變化影響

2.9 微生物分析

兩組百合鱗莖片表面可培養(yǎng)微生物數(shù)量在貯藏過程中呈連續(xù)上升趨勢(圖7)。機(jī)械傷可能會引起微生物的生長,對照組和處理組百合鱗莖片微生物數(shù)量從最初的3.22lg CFU·g-1到分別到貯藏結(jié)束時7.36lg和5.43lg CFU·g-1。處理組菌落總數(shù)一直低于對照組,從第6 d開始,處理組微生物數(shù)量遠(yuǎn)低于對照組(p<0.05)。結(jié)果表明曲酸-海藻酸鈉涂膜處理能有效抑制微生物生長。

圖7 曲酸-海藻酸鈉涂膜對百合鱗莖片貯藏過程中可培養(yǎng)微生物變化影響

3 討論

百合鱗莖片表面褐變是限制其品質(zhì)和保質(zhì)期的主要原因。本研究結(jié)果表明,曲酸-海藻酸鈉復(fù)合液涂膜處理對維持百合鱗莖片表面顏色有明顯效果,這些結(jié)果與鞏慧玲等利用納他霉素殼聚糖復(fù)合涂膜對蘭州百合鱗莖片保鮮效果相似[25],均能抑制百合鱗莖片的褐變。

機(jī)械傷(切割、鮮切、預(yù)處理)導(dǎo)致果蔬PPO和POD活性普遍升高,進(jìn)一步引起褐變[26]。在此次研究中,涂膜處理組PPO和POD活性均低于對照組,因為曲酸-海藻酸鈉復(fù)合膜具有一定的氣體選擇性,在百合鱗莖片表面形成一個低氧環(huán)境[27],維持環(huán)境較低pH,同時復(fù)合膜中的曲酸與酚類底物具有相似結(jié)構(gòu),降低PPO和POD與酚類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)程度,防止生成黑色素,減緩百合鱗莖片褐變[28]。切割會導(dǎo)致 PAL 活性增加,進(jìn)而使酶促褐變底物酚類物質(zhì)的合成累積,加速褐變[29]。加工處理會激活果蔬苯丙烷代謝,進(jìn)而導(dǎo)致 PAL活性增加,隨之會產(chǎn)生較多木質(zhì)素等次生物質(zhì)來減少果蔬自身受到的傷害,合成物質(zhì)增多后,這些物質(zhì)又會反過來抑制 PAL 活性,減少營養(yǎng)物質(zhì)消耗[30]。

此次研究中,百合鱗莖片總酚含量呈上升趨勢,處理組百合鱗莖片總酚含量始終低于對照組。酚類化合物合成與PAL酶有關(guān),涂膜處理抑制了PAL酶活性,減緩了總酚含量的上升。涂膜處理的百合鱗莖片醌類含量在第9 d后明顯低于對照組,涂膜能減緩醌類物質(zhì)的生成,抑制其進(jìn)一步聚合生成黑色素,減輕百合鱗莖片褐變程度。兩組百合鱗莖片MDA含量呈增長趨勢,是因為鮮切或輕微加工百合鱗莖片引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,造成膜脂過氧化反應(yīng),導(dǎo)致MDA含量上升[31],而處理組的MDA含量明顯低于對照組,是因為曲酸-海藻酸鈉復(fù)合液涂膜處理將保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性,有助于減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[32-33],延緩百合鱗莖片的褐變。涂膜處理能夠抑制微生物正常生長[34-35],這與曲酸-殼聚糖作為抑制劑抑菌效果一致,同時涂膜處理使得百合鱗莖片與外界環(huán)境細(xì)菌、真菌得以隔離,減少了微生物對百合鱗莖片的污染[36],有效防止了百合鱗莖片腐敗變質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究探討了曲酸-海藻酸鈉復(fù)合液涂膜處理對百合鱗莖片褐變抑制和品質(zhì)保持效果,研究表明,曲酸-海藻酸鈉復(fù)合膜最佳配方為:海藻酸鈉、甘油及曲酸濃度分別為8 g/L、0.3%和1.0 g/L。最佳的復(fù)合液涂膜處理可以有效抑制百合鱗莖片褐變,能顯著(p<0.05)保持色度、硬度,抑制丙二醛含量的升高,減緩PAL、PPO、POD、總酚和醌類的升高,從而保持了百合鱗莖片片貯藏期間的品質(zhì)。因此,曲酸-海藻酸鈉復(fù)合液涂膜可能是保存百合鱗莖片安全有效的方法之一。

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