唐利紅 麻慶樂 盧德趙

動脈粥樣硬化病變處新生血管具有滲透性高、脆性大等特點，易使脂質及各種炎細胞浸潤斑塊[1]。而新生血管僅由一層內(nèi)皮細胞構成，易破裂并誘發(fā)斑塊內(nèi)出血，從而促進動脈粥樣硬化病變的發(fā)展[2]?？梢姡瑑?nèi)皮細胞新生血管致使斑塊不穩(wěn)定是動脈粥樣硬化發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)，而抑制血管新生是防治動脈粥樣硬化的策略之一[3-5]。內(nèi)質網(wǎng)應激與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展有著密切關系。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regu－lated protein 78kD，GRP78）是內(nèi)質網(wǎng)上重要的分子伴侶，是內(nèi)質網(wǎng)應激的標志蛋白。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，所有能激活內(nèi)質網(wǎng)應激的環(huán)境或化學因素都能相應提高血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）mRNA及轉錄后水平，且GRP78 mRNA表達與VEGF mRNA表達一致，故推測GRP78表達與斑塊新生血管密切相關[6]。黃連素是一種異喹啉類生物堿，可從黃連、黃柏、三棵針等植物提取，具有穩(wěn)定斑塊、改善動脈粥樣硬化病變程度的作用[7-8]。本研究通過體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞，觀察GRP78在內(nèi)皮細胞新生血管中的表達及黃連素的干預作用，探討黃連素的抗動脈粥樣硬化作用及其可能機制，為動脈粥樣硬化的治療提供新靶點，為黃連素的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）細胞株：人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），由浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院實驗室保存。（2）藥物與試劑：黃連素（AB271B，中國天津一方科技有限公司），F(xiàn)BS（1414876，以色列 Biological Industries公司），4-苯基丁酸（4-PBA，P21005，美國 Sigma公司），毒胡蘿卜素（TG，T9033，美國Sigma公司），GRP78抗體（11587-1-AP，中國武漢三鷹公司），VEGF抗體（A20150906104，中國Cloud-Clone Crop公司），缺氧誘導因子1α（HIF-1α）抗體（B3301，美國 Immuno Way公司），β-actin抗體（00211510，中國康為世紀生物公司）。（3）主要儀器：酶標儀（Spectra Max 190，美國Molecular Devices公司），qRT-PCR儀（Step One Plus，美國 Applied Biosystems公司），半干轉膜儀（Trans-Blot Turbo，美國 Bio-RAD 公司），顯微鏡（BX53，日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC培養(yǎng)與傳代 HUVEC接種于含10%無菌FBS、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）高糖培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞為貼壁細胞，呈長梭狀。每天觀察細胞形態(tài)，當細胞密度達到90%時，進行細胞傳代培養(yǎng)，實驗使用對數(shù)生長期的HUVEC。

1.2.2 細胞增殖能力檢測 采用噻唑藍（MTT）法。取對數(shù)生長期HUVEC，0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞密度為5×103/ml，每孔 100μl接種于 96孔板中，置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用含 0、25、50、75、100、200μmol/L 黃連素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，每組設6個復孔。在培養(yǎng)結束前4h，每孔加入 MTT（5mg/ml）溶液 20μl。培養(yǎng)結束后，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μl溶解結晶物，用酶標儀于490nm波長處測定吸光度，計算細胞相對存活率。

1.2.3 細胞分組 將處于對數(shù)生長期的HUVEC分為6組：對照組（正常培養(yǎng)的HUVEC），GRP78抑制劑4-PBA組（4-PBA 5mmol/L作用 24h），GRP78激動劑TG組（TG 300nmol/L作用 24h），黃連素低、中、高劑量組（TG 300nmol/L 聯(lián)合 50、75、100μmol/L 黃連素分別作用24h）。

1.2.4 細胞遷移能力檢測 采用劃痕法。取對數(shù)生長期HUVEC，0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞密度為2.5×105/ml，每孔2ml接種于6孔板中，置細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞鋪滿單層后棄原培養(yǎng)液。用200μl槍頭在6孔板底部單層細胞平行劃痕，PBS洗3次，按照實驗設計分別加入不含血清的含藥培養(yǎng)液，置細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后拍照，利用Image J軟件分析細胞間距離，即遷移距離。

1.2.5 細胞成血管能力檢測 采用體外Matrigel Matrix膠法。將各組處理好的HUVEC胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，按每孔100μl細胞懸液的量接種于Matrix膠包被的96孔板，置細胞培養(yǎng)箱中孵育6h，鏡下觀察并拍照，利用Image-Pro plus 6.0軟件分析管腔數(shù)目。

1.2.6 VEGF、GRP78、HIF-1α mRNA表達的檢測 采用qRT-PCR法。Trizol法提取各組HUVEC中總RNA，紫外分光光度計測定總RNA的純度及濃度。根據(jù)反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA第一鏈，采用qRTPCR進行擴增，引物序列見表1。擴增條件：95℃預變性 5min；95℃變性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸 5s，共擴增 40 個循環(huán)。計算公式 Ratio=2-ΔΔCT，ΔCT1=對照目的基因CT值-對照內(nèi)參基因CT值，ΔCT2=實驗組目的基因 CT 值-實驗組內(nèi)參基因 CT 值，ΔΔCT=ΔCT2-ΔCT1。代入公式計算Ratio，即mRNA相對表達量。

表 1 VEGF、GRP78、HIF-1α 引物序列

1.2.7 VEGF、GRP78、HIF-1α 蛋白表達的檢測 采用Western blot法。提取各組細胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）法測定蛋白濃度，取20μg蛋白上樣，調(diào)整樣品至相同濃度，與上樣緩沖液混合，100℃煮沸變性5min。經(jīng)5%濃縮膠和10%分離膠進行電泳分離后，半干轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2h，將膜轉入含一抗（β-actin 1∶3 000稀釋，VEGF、GRP78、HIF-1α 1∶1 000 稀釋） 的 TBST中，4℃孵育過夜。室溫下TBST洗膜4次，10min/次，將膜轉入含二抗（辣根過氧化物酶標記的二抗1∶8 000稀釋）的TBST中，室溫孵育2h；室溫下TBST洗膜4次，10min/次。增強化學發(fā)光（ECL）顯色，化學發(fā)光成像儀曝光1～2min，掃描圖像并分析灰度，以目的蛋白/βactin的比值為蛋白相對表達量。

1.2.8 細胞內(nèi)GRP78的定位觀察 采用免疫熒光法。將細胞接在玻片上，放入6孔板中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞密度適中（60%～75%）；取出玻片，在 PBS（pH7.0）中蘸洗10次，吸干多余液體，放入每孔裝有2ml多聚甲醛的6孔板中，室溫固定10～15min；取出固定好的玻片，在PBS中蘸洗10次，放在干凈的載玻片上。在玻片上滴加相應抗體4°C過夜。次日玻片在PBS中蘸洗20次，放在載玻片上，滴加熒光二抗，常溫避光放置1h。在PBS中蘸洗20次，封片。在熒光顯微鏡下觀察GRP78定位及表達情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度黃連素對細胞增殖能力的影響 與對照組（黃連素濃度為0）比較，黃連素濃度為25、50、75、100μmol/L組細胞相對存活率均略有下降，但差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；黃連素濃度為200μmol/L組細胞相對存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。因此，本實驗黃連素的處理劑量選擇50、75、100μmol/L。

圖1 不同濃度黃連素對細胞增殖能力的影響（與0μmol/L組比較，*P＜0.05）

2.2 黃連素對細胞遷移能力的影響 與對照組比較，4-PBA組細胞遷移距離明顯較短（P＜0.05）；TG組細胞遷移距離明顯較長（P＜0.05），24h時已遷移至接近匯合。與TG組比較，黃連素低、中、高劑量組細胞遷移距離明顯較短（均P＜0.05），說明黃連素能抑制TG誘導的細胞遷移，見圖2。

圖2 黃連素對細胞遷移能力的影響（a：對照組；b：4-PBA組；c：TG組；d：黃連素低劑量組；e：黃連素中劑量組；f：黃連素高劑量組；與對照組比較，*P＜0.05；與 TG 組比較，△P＜0.05；×400）

2.3 黃連素對細胞成血管能力的影響 與對照組比較，4-PBA組管腔數(shù)目明顯減少（P＜0.05），4-PBA能抑制內(nèi)皮細胞血管生成；TG組管腔數(shù)目明顯增多（P＜0.05），TG可誘導內(nèi)皮細胞血管生成。與TG組比較，黃連素低、中、高劑量組管腔數(shù)目均明顯減少（均P＜0.05），說明黃連素能抑制TG誘導的內(nèi)皮細胞血管生成，且呈一定的濃度依賴性，見圖3。

2.4 黃連素對HUVEC中 VEGF、GRP78、HIF-1α mRNA表達的影響 與對照組比較，TG組HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1αmRNA相對表達量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與TG組比較，黃連素中、高劑量組 HUVEC 中 VEGF、GRP78、HIF-1α mRNA 相對表達量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖 4。

2.5 黃連素對HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α 蛋白表達的影響 與對照組比較，TG組HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α蛋白相對表達量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與TG組比較，黃連素低、中、高劑量組HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α蛋白相對表達量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖 5。

圖5 黃連素對HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α 蛋白表達的影響（a：對照組；b：4-PBA組；c：TG組；d：黃連素低劑量組；e：黃連素中劑量組；f：黃連素高劑量組；與對照組比較，*P＜0.05；與 TG 組比較，△P＜0.05）

2.6 黃連素對細胞膜上GRP78表達的影響 熒光顯微鏡下觀察GRP78分布于內(nèi)皮細胞的細胞膜上，TG刺激后細胞膜上GRP78高表達，而4-PBA（5mmol/L）及黃連素（50、75、100μmol/L）能明顯降低細胞膜上 GRP78表達，見圖 6（插頁）。

圖6 黃連素對細胞膜上GRP78表達的影響（a：對照組；b：4-PBA組；c：TG組；d：黃連素低劑量組；e：黃連素中劑量組；f：黃連素高劑量組；紅色信號代表GRP78，藍色信號代表細胞核，合成圖片可觀察GRP78在細胞膜上表達情況；×200）

3 討論

斑塊內(nèi)病理性新生血管是動脈粥樣硬化進展及不穩(wěn)定斑塊形成的關鍵之一，抗血管新生研究對于動脈粥樣硬化進展及不穩(wěn)定斑塊形成的防治具有重要意義。國內(nèi)外研究表明，抑制血管新生能夠延緩動脈粥樣硬化進程[9-12]。本研究應用黃連素作為抗血管新生藥物，主要考慮到目前常規(guī)治療動脈粥樣硬化的他汀類藥物費用昂貴，且存在肝損傷、肌肉溶解等不良反應。黃連素一直被傳統(tǒng)中醫(yī)用于治療腹瀉、痢疾、瘧疾等胃腸道感染性疾病[13]；近年來，多項基礎研究證實黃連素是一種機制完全不同于他汀類降脂作用的中藥單體[14-16]，可有效治療動脈粥樣硬化，且安全性高、價格低廉。因此，深入研究黃連素抗動脈粥樣硬化機制、拓展其臨床應用具有積極意義。

動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管主要由外膜的滋養(yǎng)血管芽生而來，隨著斑塊內(nèi)炎癥反應增強和斑塊體積增大，斑塊內(nèi)的新生血管數(shù)量逐漸增多，并逐漸向血管內(nèi)皮下生長[17-18]。新生血管的結構不完善，管壁薄，內(nèi)皮細胞間連接不緊密[19]。新生血管的高滲透性會導致血液中脂質、炎癥細胞和紅細胞從管腔中漏出，進入斑塊內(nèi)環(huán)境，加上血管易破裂使得斑塊內(nèi)出血的可能性增大，從而加重管腔狹窄[20]。本文通過體外血管生成實驗證實黃連素具有抑制內(nèi)皮細胞增殖、遷移及成血管能力。

為了揭示黃連素抗血管生成的作用機制，筆者探討了GRP78與血管新生的關系。GRP78是內(nèi)質網(wǎng)中極其豐富的分子伴侶蛋白，也被稱作免疫球蛋白重鏈結合蛋白，是啟動內(nèi)質網(wǎng)應激時未折疊蛋白反應（UPR）級聯(lián)合信號途徑[21]。越來越多研究表明，內(nèi)質網(wǎng)應激對動脈粥樣硬化血管生成起著關鍵作用，在動脈粥樣硬化性疾病中，內(nèi)質網(wǎng)應激通過UPR系統(tǒng)中應激信號跨膜感受蛋白相關的機制上調(diào)VEGF表達，從而促進血管生成。在內(nèi)質網(wǎng)應激時，GRP78可阻止未折疊蛋白合成及錯誤折疊蛋白聚集，促進其正確折疊，從而恢復內(nèi)質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[22]。那么，GRP78與血管新生的關系如何呢？Annat等[23]研究表明，內(nèi)皮細胞受刺激后GRP78在細胞膜上的表達與血管新生有關。本實驗采用GRP78激動劑TG及抑制劑4-PBA干預HUVEC，發(fā)現(xiàn)TG能有效促進其遷移及管狀結構形成，而4-PBA處理后效果相反，這證實GRP78可誘導內(nèi)皮細胞血管生成。VEGF是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一特異性促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂的生長因子，是一種具有促進血管新生和組織修復的血管生成因子[24]。由于動脈粥樣硬化斑塊形成時，內(nèi)環(huán)境處于缺氧狀態(tài)，有氧代謝細胞中HIF-1α會被激活且不斷積累，并能穩(wěn)定表達蛋白，通過誘導VEGF表達，特異性地結合位于新生血管內(nèi)皮上的VEGF受體，促進內(nèi)皮細胞生長，形成新的血管管腔，以維持斑塊內(nèi)的氧供需平衡[25]。筆者進一步對HUVEC中VEGF、HIF-1α表達進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)GRP78的表達與VEGF、HIF-1α的表達一致，說明GRP78誘導VEGF、HIF-1α表達的血管生成機制是一個獨立的機制。采用黃連素干預TG刺激后的HUVEC，VEGF、HIF-1α、GRP78表達均明顯下降，且細胞遷移、成血管能力均明顯減弱，這說明黃連素可能通過調(diào)控VEGF、HIF-1α、GRP78表達的機制從而抑制內(nèi)皮細胞血管新生。同時，免疫熒光法觀察并證實了4-PBA及黃連素能明顯降低細胞膜上GRP78表達。

綜上所述，GRP78與內(nèi)皮細胞新生血管有關。GRP78激動劑TG可增加VEGF、GRP78、HIF-1α的mRNA和蛋白表達，增強細胞遷移、成血管能力；經(jīng)黃連素處理后，內(nèi)皮細胞中 VEGF、GRP78、HIF-1α 的 mRNA 和蛋白表達量降低，細胞遷移、成血管能力減弱。黃連素可能通過抑制GRP78表達從而抑制內(nèi)皮細胞血管新生。