郭廣洋 王 宏

本溪市中心醫(yī)院(遼寧 本溪 117000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是常見的急腹癥內(nèi)科疾病之一，是由多種病因?qū)е乱认賰?nèi)胰酶被激活從而引發(fā)胰腺組織自身的炎癥反應(yīng)[1]。急性胰腺炎主要包括輕癥急性胰腺炎(MAP)、中度重癥急性胰腺炎(MSAP)和重癥急性胰腺炎(SAP)[2]。AP 的臨床診斷主要結(jié)合急性胰腺炎臨床癥狀、血生化指標以及影像學檢查等，但這些診斷方法缺乏特異性，可能出現(xiàn)誤、漏診[3]。臨床上評估急性胰腺炎患者病情及預(yù)后常用的方法包括Ranson 評分、CT嚴重度指數(shù)(CTSI)評分等，各評分系統(tǒng)也均存在各自的優(yōu)缺點。MicroRNA是一種非編碼RNA，可以調(diào)控靶基因表達，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用[4]。研究表明[5]，miR-155作為炎性調(diào)控因子在AP病理過程中發(fā)揮重要的作用，通過抑制 miR-155 在小鼠中的表達，能顯著改善小鼠胰腺的病理學損傷。本研究檢測急性胰腺炎患者血miR-155表達水平，為探討其作為早期預(yù)測及預(yù)后的血清學標志物提供實驗基礎(chǔ)。

1 方法

1.1對象和分組 選取我院2016年3月～2018年3月收治的40例急性胰腺炎患者為病例組，分為輕癥急性胰腺炎患者(MAP 組，n=20)和重癥急性胰腺炎患者(SAP 組，n=20)，并隨機選取同期20例健康體檢者為對照組(Con組，n=20)。

1.2材料和試劑 血清/血漿microRNA快速提取試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司、反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司。

1.3血漿樣品的制備 空腹采集各組患者外周靜脈血5 mL，肝素鈉抗凝，4 ℃靜置1 h，2000 r/min，離心10 min，收集上清液置于RNase-free離心管中，保存于液氮中備用。

1.4血漿microRNA的提取及Real-Time PCR 應(yīng)用microRNA快速提取試劑盒，按照試劑盒說明書步驟提取血漿中的microRNA，紫外分光光度計測量RNA濃度，取300 ng RNA樣品進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后取2ul cDNA進行qPCR檢測，反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性10sec，95°C5sec，60°C20sec，擴增40個循環(huán)。miR-155的相對表達量以試劑盒內(nèi)的U6引物為內(nèi)參，采用 2-△△ct法進行分析。miR-155引物序列為F:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTT-GAGACCCCTAT-3’，R:5’-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAT-3’。

1.5急性胰腺炎病情嚴重程度評估 ①Ranson評分[6]：由入院時檢測的5 項指標以及入院48 h 時檢測的6 項指標組成，每項指標記為1分，總分<3 分為輕癥急性胰腺炎，總分≥3 分為重癥急性胰腺炎。②CT 嚴重程度指數(shù)(MCTSI)評分[7]，總分為10分，急性胰腺炎形態(tài)學改變依照MCTSI分為MAP(0～3分)、MSAP(4～6)和SAP(7～10分)

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準表示，多組間獨立樣本比較采用方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P< 0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1三組患者血漿中miR-155表達水平的檢測 提取患者外周血漿microRNA，反轉(zhuǎn)錄后通過Real-Time PCR檢測miR-155的表達水平，采用 2-△△ct法進行分析，結(jié)果顯示：與對照組相比，MAP 組和SAP 組患者血漿miR-155表達水平升高(P<0.05)，且SAP 組miR-155表達水平高于MAP 組(P<0.05)(圖1)。

圖1 血漿miR-155Real-Time PCR檢測結(jié)果注:* 與Con組比較，P<0.05；#與MAP組比較，P<0.05

2.2血漿miR-155 表達與急性胰腺炎患者臨床特征的關(guān)系 AP患者外周血血漿中miR-155表達量與年齡、性別無關(guān)(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。不同Ranson 評分及MCTSI 評分的急性胰腺炎患者血漿中miR-155表達量不同，Ranson 評分≥3 分、改良的CT 嚴重指數(shù)(MCTSI)評分≥4 分，急性胰腺炎患者血漿miR-155表達水平高于Ranson 評分<3 分、MCTSI 評分<4 分，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)見表1。

表1 急性胰腺炎患者臨床特征與血漿miR-155表達的關(guān)系

3 討論

急性胰腺炎是臨床上常見的炎癥性疾病之一，它不僅累及胰腺及周圍組織，治療不及時還可以誘發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征、膿毒癥、休克以及多器官功能障礙綜合征等，病死率較高[8-9]。急性胰腺炎的主要臨床表現(xiàn)包括急性發(fā)作的持續(xù)性上腹部劇痛，常伴有背部放射性疼痛、惡心及嘔吐等。輕癥患者癥狀不明顯，主要表現(xiàn)為腹部輕壓痛，重癥患者表現(xiàn)為上腹部持續(xù)性刀割樣劇烈疼痛，可蔓延至全腹，出現(xiàn)腹膜刺激征[10]。急性胰腺炎的臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)多樣性，能夠反映病情嚴重程度的臨床表現(xiàn)的特異性差，對于不良預(yù)后的預(yù)測敏感性低[11]。臨床上，實驗室各類血生化檢測指標常用于判斷急性胰腺炎病情的嚴重程度，如血漿 C 反應(yīng)蛋白(CRP)、尿素氮、酯酶和淀粉酶等；但這些診斷方法也缺乏特異性，其他疾病如急性闌尾炎，腸梗阻等疾病也能引起類似酯酶和淀粉酶的增高的表現(xiàn)[12]。各類評分系統(tǒng)如 Ranson 評分、急性生理和慢性健康狀況評分(APACHEⅡ)評分、CTSI評分、急性胰腺炎床邊嚴重指數(shù)評分(BISAP)評分、胰腺炎結(jié)局預(yù)測(POP)評分系統(tǒng)等，也常用于判斷急性胰腺炎病情的嚴重程度及愈后，這些評分系統(tǒng)種類較多，各有優(yōu)勢和缺點。一些評分系統(tǒng)如Ranson 評分、APACHE Ⅱ評分雖得到認可，但因其所涵蓋的因素較多，臨床應(yīng)用較為困難，其他簡易評分如POP等，還缺乏足夠的驗證及研究，所以尋找特異性的生物標記物，對急性胰腺炎的早期診斷、病情評估、臨床治療及預(yù)后評價都具有重要的意義。

microRNA作為一種非編碼 RNA，與靶基因的 3′非編碼區(qū)結(jié)合，抑制靶基因mRNA 的翻譯，調(diào)控靶基因表達，在許多病理、生理過程中發(fā)揮重要的作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，一些microRNA可以作為急性胰腺炎診斷和預(yù)后潛在的生物標志物[14-16]。應(yīng)用SAP小鼠動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，在動物模型的胰腺和腸上皮細胞中，miR-155的表達顯著增高，通過抑制 miR-155的表達，能顯著改善小鼠胰腺的病理學損傷[5-17]，說明miR-155的表達與急性胰腺炎的發(fā)生密切相關(guān)。

本研究檢測急性胰腺炎患者血漿中miR-155的表達水平，結(jié)果顯示：與對照組相比，MAP 組和SAP 組患者血漿miR-155表達水平升高(P<0.05)，且SAP 組miR-155表達水平高于MAP 組(P<0.05)，隨著病情的嚴重程度增加，miR-155的表達增加，這表明miR-155有可能成為胰腺炎診斷的生物標志物。本實驗分析了miR-155表達與部分臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AP患者外周血血漿中miR-155表達量與患者的年齡、性別無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同Ranson 評分及MCTSI 評分的急性胰腺炎患者血漿中miR-155表達量不同，Ranson 評分≥3 分、改良的CT 嚴重指數(shù)(MCTSI)評分≥4 分，急性胰腺炎患者血漿中的miR-155 表達水平高于Ranson 評分<3 分、MCTSI 評分<4 分的急性胰腺炎患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

本研究通過檢測血漿miR-155作為診斷急性胰腺炎及鑒別其嚴重程度的生物學標記物，發(fā)現(xiàn)其在急性胰腺炎患者中高表達且表達程度與疾病嚴重程度呈現(xiàn)正相關(guān)，為進一步探討其作為早期診斷及預(yù)后的血清學標志物提供了實驗基礎(chǔ)。