陳育華 周碧云 梁斯鍶 廖德權(quán) 霍恕婷

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.介入病區(qū)；3.骨科一區(qū)，廣東 湛江 524001)

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是引起人類呼吸道感染的常見病原體，在小兒呼吸道疾病中肺炎支原體的感染率逐年升高,患兒感染后引起以發(fā)熱、流涕、鼻塞、咽 痛、咳嗽為主要癥狀的上呼吸道感染癥狀[1]，還能引發(fā)間質(zhì)性肺炎和其他肺外并發(fā)癥。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為除了病原體的直接侵害，還能引起機(jī)體細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能紊亂。本文對(duì)2018年1月-2018年8月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的46例Mp患兒進(jìn)行了T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、白細(xì)胞分類、免疫球蛋白、C反應(yīng)蛋白、補(bǔ)體水平進(jìn)行檢測(cè)，從而探討肺炎支原體感染機(jī)體后引起機(jī)體的免疫功能變化。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 46例Mp 患兒均來自2018年1月-8月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院患兒。其中男26例，女20例，年齡3個(gè)月～10歲，平均年齡4.7歲，46例患兒血清學(xué)檢測(cè)Mp-IgM均為陽性。臨床表現(xiàn)均有發(fā)熱、流涕、咳嗽等上呼吸道感染癥狀。對(duì)照組1為50例與Mp感染患兒有相似臨床癥狀但血清學(xué)檢測(cè)Mp-IgM陰性的兒童，其中男28例，女22例。年齡2個(gè)月～10歲，平均年齡2.5歲，年齡、性別與實(shí)驗(yàn)組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)照組2為44例健康體檢兒童，其中男25例，女19例，年齡4～16歲，平均年齡5.8歲，年齡、性別與實(shí)驗(yàn)組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2研究方法

1.2.1 T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的檢測(cè)取CD3+-PC5、CD4+-PE、CD8+-ECD、CD(16+56+)-PE 和 CD3-CD19+-PE鼠抗人熒光單克隆抗體(由美國(guó) Beckman Coulter 公司生產(chǎn))各4 μl抗體(NK細(xì)胞和B細(xì)胞的檢測(cè)需要10 μl)加入試管中→再加入50 μl抗凝全血，充分混勻→暗處室溫(20～25 ℃)孵育 15 min→加Op-tilyse C 溶血?jiǎng)?500 μl 溶血(37 ℃預(yù)熱)，混勻，避光放置15 min→再加入3 mlPBS，旋渦混勻后2500 r/min離心3 min→吸掉上清后再加500 μlPBS，混勻在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)外周血中的 T 淋巴細(xì)胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+以及B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的表達(dá)率。

1.2.2 白細(xì)胞及白細(xì)胞分類的檢測(cè)采取Beckman Coulter LH750 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)及白細(xì)胞分類比例，嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行操作，試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品均為Beckman Coulter 公司提供。

1.2.3 免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、總IgE)、C反應(yīng)蛋白、補(bǔ)體(C3、C4)的檢測(cè) 采用Beckman Coulter公司提供的 IMMAGE 800特定蛋白分析儀檢測(cè)患兒血清中免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、總IgE)、C反應(yīng)蛋白、補(bǔ)體(C3、C4)。嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行操作，試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品均為Beckman Coulter 公司提供。

2 結(jié)果

2.1三組外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+、CD3-CD19+檢測(cè)結(jié)果比較(見表1及圖1～圖5) 與對(duì)照組2比較，實(shí)驗(yàn)組外周血CD3+T細(xì)胞比例、CD3+TCD4+T細(xì)胞比例、CD16+CD56+NK細(xì)胞比例明顯下降，CD3+CD8+T細(xì)胞比例明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組1比較，實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 三組全血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+、CD3-CD19+檢測(cè)結(jié)果比較

備注：*與對(duì)照組2比較，P<0.05。

圖1 總T淋巴細(xì)胞流式散點(diǎn)圖

圖2 CD4+T淋巴細(xì)胞流式散點(diǎn)圖

圖3 CD8+T淋巴細(xì)胞流式散點(diǎn)圖

圖4 NK細(xì)胞流式散點(diǎn)圖

圖5 B淋巴細(xì)胞流式散點(diǎn)圖

2.2三組外周血白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞比例檢測(cè)結(jié)果比較(見表2) 與對(duì)照組2比較，實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞總數(shù)增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05。與對(duì)照組1比較，實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞比例增高，淋巴細(xì)胞比例減低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 三組外周血白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞比例檢測(cè)結(jié)果比較

備注：*與對(duì)照組2比較，P<0.05；△與對(duì)照組1比較，P<0.05。

2.3三組血清中免疫球蛋白、補(bǔ)體(C3、C4)、C反應(yīng)蛋白檢測(cè)結(jié)果比較(見表3) 與對(duì)照組2比較，實(shí)驗(yàn)組IgG含量下降，IgM含量、CRP含量上升，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組1比較，實(shí)驗(yàn)組IgM含量、IgA含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 三組血清中免疫球蛋白、補(bǔ)體(C3、C4)、C反應(yīng)蛋白檢測(cè)結(jié)果比較

注：*與對(duì)照組2比較，P<0.05；△與對(duì)照組1比較，P<0.05。

3 討論

臨床上診斷肺炎支原體病，血清學(xué)抗體檢測(cè)法、核酸檢測(cè)法和MP培養(yǎng)法為主要檢測(cè)方法[2]。其中，MP分離培養(yǎng)及鑒定，仍然是確診MP感染的最重要手段。不過，由于肺炎支原體不易培養(yǎng)，臨床上很少用分離培養(yǎng)的方法鑒定呼吸道標(biāo)本中的肺炎支原體，可以用血清學(xué)試驗(yàn)中 IgM 抗體陽性作為臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。

CD3是成熟T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志，它作為主要免疫細(xì)胞參與機(jī)體的免疫應(yīng)答,其數(shù)量的多少通?？勺鳛榕袛鄼C(jī)體免疫狀態(tài)低下或過激的標(biāo)準(zhǔn)[3]。本研究顯示，CD3+T細(xì)胞明顯低于正常對(duì)照組，提示隨著患兒病情的加重，成熟T細(xì)胞數(shù)量下降越明顯，T細(xì)胞免疫功能下降。CD4是輔助性T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞)的表面標(biāo)志，具有輔助T、B淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能，可與MHCⅡ類分子結(jié)合，參與Th細(xì)胞第一活化信號(hào)的產(chǎn)生；而CD8是細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的表面標(biāo)志，與MHCI類分子結(jié)合，參與CTL細(xì)胞第一活化信號(hào)的產(chǎn)生。結(jié)果顯示MP患兒CD4+/CD8+較正常對(duì)照組下降，這是由于兒童感染MP后,機(jī)體所產(chǎn)生的抗體可與自身抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,引發(fā)免疫應(yīng)答,產(chǎn)生炎性因子,導(dǎo)致除呼吸系統(tǒng)外的其他多個(gè)系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生,從而使CD4+降低,CD8+升高,CD4/CD8比值倒置，機(jī)體免疫功能失調(diào)[4]。CD19是成熟B淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志，CD16、CD56是NK細(xì)胞的表面標(biāo)志，研究顯示MP患兒CD19+比正常對(duì)照組顯著增高，提示患兒體內(nèi)B細(xì)胞異常活化增值，分泌大量抗體，參與體液免疫反應(yīng)。NK細(xì)胞無需抗原致敏就能直接殺傷靶細(xì)胞，廣泛參與機(jī)體抗腫瘤、抗感染效應(yīng)機(jī)制，并且僅殺傷異常細(xì)胞，對(duì)宿主正常細(xì)胞一般無細(xì)胞毒作用。MP患兒NK細(xì)胞比正常對(duì)照組顯著下降，提示患兒感染MP后NK細(xì)胞增殖受阻，使患兒感染期延長(zhǎng)，本研究流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果與鄧永超等[5-7]結(jié)果相同。

白細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)人體免疫功能發(fā)揮重要作用，當(dāng)白細(xì)胞水平急劇上升時(shí)，則反映出機(jī)體有炎癥的可能[8]。本研究顯示MP患兒全血中白細(xì)胞總數(shù)僅與對(duì)照組2有差異，這與陳士建[8]的研究結(jié)果不一樣，可能與本研究樣本例數(shù)不足有關(guān)。雖然白細(xì)胞數(shù)量會(huì)隨著MP的感染有一定的上升或下降，但受采血時(shí)間、個(gè)體差異、儀器狀況等臨床因素影響，一些MP患兒常出現(xiàn)血常規(guī)無明顯變化的情況。并且一些學(xué)者指出白細(xì)胞這些指標(biāo)結(jié)果波動(dòng)幅度大，波動(dòng)幅度可達(dá)到 30%～50%[9]，對(duì)臨床診斷造成干擾。故除血常規(guī)之外，應(yīng)結(jié)合其他指標(biāo)綜合考慮MP患兒機(jī)體的免疫功能。

本研究中，MP患兒IgM明顯高于正常對(duì)照組，而IgG明顯低于對(duì)照組，提示 MP 感染后刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，可導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞的的異常增殖、活化，產(chǎn)生特異性抗體和非特異性抗體。血清中檢出IgM提示患兒近期發(fā)生感染，可用于臨床早期診斷MP感染。有研究表明[5]，IgM在機(jī)體感染MP一周后產(chǎn)生，3-4周達(dá)頂峰。IgG較IgM出現(xiàn)時(shí)間較晚，血清中含量未增高可能與患兒所處感染階段有關(guān)。而Ig A含量增高，但與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陳開革等[10,11]認(rèn)為，Ig A 可作為新近發(fā)生MP 感染的一個(gè)指標(biāo)，在 MP感染早期迅速升高，其抗體水平的下降較 Ig G 和 Ig M 提前。出現(xiàn)這種差異可能與儀器、方法、采集時(shí)間、標(biāo)本狀態(tài)不同有關(guān)。C3、C4含量增高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MP患兒感染后，與激活補(bǔ)體有關(guān)。

C-反應(yīng)蛋白是一種在肝細(xì)胞內(nèi)合成的可以結(jié)合肺炎球菌細(xì)胞壁多糖的蛋白質(zhì)[12]。CRP作為急性時(shí)相反應(yīng)的一個(gè)極靈敏的指標(biāo)，常在急性心肌梗死、創(chuàng)傷、感染、炎癥、外科手術(shù)、腫瘤浸潤(rùn)時(shí)顯著地增高[13]。本研究MP患兒血清中CRP水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與龔萍[12]等人研究結(jié)論相同，但CRP是非特異指標(biāo)，當(dāng)其血漿濃度升高一定程度時(shí)只能作為機(jī)體明顯的炎癥信號(hào)而不能特異診斷某種疾病。

總之，肺炎支原體感染患兒與健康兒童對(duì)比，存在細(xì)胞免疫和體液免疫功能紊亂，臨床醫(yī)生在治療患兒時(shí)，應(yīng)適當(dāng)采用免疫調(diào)理，縮短患兒病程，提高患兒的治病率。