劉成芳，劉繼斌，王瑾，和榮麗，孔麗，吳博威

慢性心力衰竭是多種心血管疾病的終末階段和共同歸宿[1-2]。心肌纖維化是慢性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要病理變化之一，其主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞壞死凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積、心肌僵硬度增加、順應(yīng)性降低，導(dǎo)致心臟舒縮功能不全，最終使心律失常、心力衰竭等的發(fā)生率也隨之升高[3-4]。抑制心肌纖維化可以明顯延緩心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，對改善心力衰竭患者的預(yù)后具有重要意義[5]。

心室重構(gòu)的進(jìn)程中伴有電重構(gòu)的發(fā)生，其中內(nèi)向整流鉀電流（IK1）有下調(diào)趨勢[6-7]。IK1是心肌最主要的背景外向電流，參與靜息電位的維持和心肌動作電位3 期終末的復(fù)極[8]。扎考比利是選擇性的大鼠心室肌IK1通道特異性激動劑[8-9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，通過預(yù)防性腹腔給藥，扎考比利對大鼠心肌梗死后心肌間質(zhì)重構(gòu)有明顯的改善作用：給藥組大鼠心功能明顯改善，心肌間質(zhì)膠原沉積明顯降低[9-10]。但扎考比利是否對腹主動脈縮窄后大鼠的心肌纖維化程度有所改善尚不清楚。本研究通過腹主動脈縮窄誘導(dǎo)壓力超負(fù)荷性心室重構(gòu)模型，觀察扎考比利對腹主動脈縮窄后心功能和心肌纖維化的改善作用，并分析其可能機(jī)制。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動物：雄性清潔級SD 大鼠90 只，體重200～220 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK（晉）2009-0001。

實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：氫氯扎考比利，購自英國Tocris 公司；IK1阻斷劑磷酸氯喹購自美國Sigma 公司；碘[125I]B 型利鈉肽（BNP）放射免疫分析試劑盒、125I 腫瘤壞死因子（TNF-α）放射免疫分析試劑盒，購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司；馬松（Masson）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠膠原I、膠原Ⅲ 購自美國Santa Cruz 公司；RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；SN-695A 智能放射免疫γ 測量儀（上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠）；Image-pro plus圖像分析軟件（OLYMPUS 公司，日本）。

腹主動脈縮窄模型的建立及分組：參照文獻(xiàn)[11]制作大鼠腹主動脈縮窄模型。大鼠術(shù)前12 h 禁食，自由飲水，稱重后用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉。常規(guī)備皮、消毒后于劍突下縱向切開腹部皮膚、肌層，并沿腹白線打開腹腔，用生理鹽水紗布將腸管小心向下推移，充分暴露腹主動脈段。在左腎動脈上方0.5 cm 處鈍性分離腹主動脈，平行放置7 號針頭（直徑0.7 mm），并將7 號針頭與腹主動脈一起結(jié)扎后，抽出空針，造成腹主動脈縮窄（橫截面減少約50%）。逐層縫合腹肌和皮膚，以青霉素40 萬U/d 連續(xù) 3 d 抗感染。將建模成功的80 只大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表分為模型組、扎考比利組、氯喹組、扎考比利+氯喹組（每組20 只）；另外10只大鼠（假手術(shù)組）開腹后只掛線，不結(jié)扎，其他程序均與建模大鼠相同。扎考比利組、氯喹組分別腹腔給予15 μg/（kg·d）、7.5 μg/（kg·d）的扎考比利和氯喹（溶于0.2 ml 生理鹽水），扎考比利+氯喹組腹腔給予扎考比利和氯喹，劑量同前，假手術(shù)組及模型組分別腹腔給予相同體積的生理鹽水，連續(xù)干預(yù)8 周。

血流動力學(xué)檢測：參照文獻(xiàn)[9]，麻醉后縱形切開大鼠頸部皮膚1.5～2 cm，分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動脈遠(yuǎn)心端，用動脈夾夾住頸總動脈的近心端，使頸總動脈充盈；將動脈剪一小口后插入1 mm 預(yù)先充滿肝素鹽水的聚乙烯導(dǎo)管；利用RM-6240B 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測量大鼠的左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末期壓力（LVEDP）、左心室壓力上升最大速率（+dP/dtmax）、左心室壓力下降最大速率（-dP/dtmax）及心率。迅速采血備用，取血完畢，迅速取出心臟，將左心室分為兩部分，分別用4%的PBS 多聚甲醛固定和-80℃超低溫冰箱儲存。

放射免疫法測定大鼠血漿中BNP 含量：血樣標(biāo)本采集后置于4℃ 30 min，3 000 rpm 離心15 min，取上清，-80℃保存。待測樣品在使用前30 min 從冰箱中取出后平衡至室溫。將100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品分別加入圓底聚苯乙烯管內(nèi)，每管內(nèi)分別加入100 μl125I 標(biāo)記的BNP 抗原和100 μl BNP 抗體，隨后按照125I 標(biāo)記的BNP 放射免疫分析說明書操作。用γ 測量儀預(yù)先編制的程序得出標(biāo)準(zhǔn)曲線和相應(yīng)大鼠血漿BNP 的含量。用同樣的方法測定大鼠血漿TNF-α 的含量。BNP 和TNF-α 試劑盒變異系數(shù)＜10%，BNP 和TNF-α 檢測的靈敏度分別≤5 ng/L和≤3 ng/ml。BNP 和TNF-α 的線性γ ≥0.9900。

心肌組織Masson 染色：心肌組織石蠟包埋、切片，行Masson 染色。Masson 法染色后光鏡下膠原纖維呈藍(lán)色，心肌纖維紅色，紅細(xì)胞橘紅色。掃描入計算機(jī)，采用Image-pro plus 圖像分析軟件測定心肌膠原面積。切片隨機(jī)取5 個視野，取其平均值。

免疫組織化學(xué)法測定大鼠心肌組織I型、Ⅲ型膠原的表達(dá)：石蠟切片脫蠟至水化，免疫組織化學(xué)法測定各組大鼠心肌組織中I型、Ⅲ型膠原的表達(dá)（兔抗大鼠I型、Ⅲ型膠原的抗體濃度為1:100）。結(jié)果判斷：以心肌間質(zhì)或血管壁周圍出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件對免疫組化切片進(jìn)行圖像分析，每張切片隨機(jī)選取4 個視野，計算平均光密度值進(jìn)行比較。

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、Smad3 及Smad7 信使RNA（mRNA）的表達(dá)：參照文獻(xiàn)[11]，分別提取各組大鼠新鮮左心室組織，用Invitrogen Trizol 進(jìn)行RNA 提取，然后將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA，根 據(jù)Genebank 序 列， 設(shè) 計TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 和β 肌動蛋白（β-actin）引物序列并合成：TGF-β1：上游5'-tgagtggctgtcttttgacg-3'，下 游5'-actgaagcgaaagccctgta-3'；Smad3 上游 引 物5'-cttggtgcagagacctgtca-3'， 下 游 引物5'-ttctctgtgattgccactgc-3'，Smad7 上 游引 物5'-ccaactgcagactgtccaga-3'， 下 游 引物5'-caggctccagaagaagttgg-3'，β-actin 上游5' -gagagggaaatcgtgcgtgac-3'， 下 游5'catctgctggaaggtggaca-3'，以β-actin 作 為 內(nèi) 參，通過2-ΔΔCt比較各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA 的相對含量。

統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 13. 0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠的血流動力學(xué)參數(shù)比較（表1）：與假手術(shù)組相比，模型組、氯喹組和扎考比利+氯喹組大鼠LVSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax均顯著降低，LVEDP 顯著升高（P 均＜0.05）；與模型組相比，扎考比利組LVSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax均顯著升高，而LVEDP 顯著降低（P 均＜0.05）。與扎考比利組相比，氯喹組和扎考比利+氯喹組大鼠LVSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax均顯著降低，LVEDP顯著升高（P 均＜0.05）。

表1 各組大鼠的血流動力學(xué)參數(shù)比較 (±s, n=6 )

放射免疫方法測定大鼠血漿BNP 和TNF-α 的含量（表2）：BNP 和TNF-α 的變異系數(shù)分別為6.21%和8.93%，未見明顯交叉反應(yīng)，抗體特異性高；BNP 和TNF-α 的最小檢測值分別為2.8 ng/L 和1.2 ng/ml，符合試劑盒的技術(shù)指標(biāo)。與假手術(shù)組相比，氯喹組和扎考比利+氯喹組大鼠血漿BNP 和TNF-α 含量均明顯升高（P 均＜0.05）；與模型組相比，扎考比利組大鼠血漿BNP 和TNF-α 的含量顯著降低（P 均＜0.05）。與扎考比利組相比，氯喹組和扎考比利+氯喹組大鼠血漿BNP 和TNF-α 含量明顯升高（P 均＜0.05）。

表2 各組大鼠血漿B 型利鈉肽和腫瘤壞死因子-α 含量（±s, n=6）

各組大鼠心肌組織Masson 染色結(jié)果：光鏡下觀察可見，假手術(shù)組心肌間質(zhì)及血管周圍僅見少量膠原沉積（圖1A），膠原面積百分比為（2.92±0.67）%；與假手術(shù)組相比，模型組膠原沉積[（27.80±3.23）%]明顯增多（P＜0.01）；扎考比利組膠原面積百分比為（11.42±1.55）%，明顯小于模型組（P＜0.01）；扎考比利+氯喹組心肌膠原面積為（24.58±3.40）%，明顯高于扎考比利組（P＜0.01，圖1B）。

免疫組織化學(xué)法測定各組大鼠心肌組織I型、Ⅲ型膠原的表達(dá)（圖2）：假手術(shù)組大鼠心肌組織I型、Ⅲ型膠原有少量表達(dá)（4.44±1.12，4.15±1.95）；與假手術(shù)組相比，模型組（16.51±2.58，9.96±1.88）、氯喹組（14.71±3.81，9.48±1.95）和扎考比利+氯喹組（15.58±2.66，9.20±3.52）大鼠心肌組織I型、Ⅲ型膠原表達(dá)均明顯升高（P 均＜0.05）；扎考比利組大鼠心肌組織I型、Ⅲ型膠原表達(dá)（6.03±2.10，5.34±1.52）均明顯低于模型組（P 均＜0.01），且I型/Ⅲ型膠原比值顯著低于模型組（1.16±0.21 vs 1.67±0.37，P＜0.01）。與扎考比利組相比，氯喹組和扎考比利+氯喹組大鼠心肌組織I型、Ⅲ型膠原表達(dá)以及I型/Ⅲ型膠原比值均明顯升高（P 均＜0.05）。

各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 和Smad7 mRNA 的表達(dá)（表3）：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA 表達(dá)明顯增多，Smad7 mRNA 表達(dá)明顯下降（P 均＜0.05）。與模型組相比，扎考比利組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA 表達(dá)明顯減少，Smad7 mRNA 表達(dá)明顯升高（P均＜0.05）。與扎考比利組相比，氯喹組和扎考比利+氯喹組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA 表達(dá)均明顯增多，Smad7 mRNA 表達(dá)均明顯下降（P 均＜0.05）。

圖2 各組大鼠心肌組織I型、Ⅲ型膠原的表達(dá)情況比較(n=6)

表3 各組大鼠心肌組織轉(zhuǎn)化生長因子β1、Smad3、Smad7 信使RNA 表達(dá)(±s, n=6 )

3 討論

在心室重構(gòu)的進(jìn)程中，先有電重構(gòu)的發(fā)生，進(jìn)而影響組織重構(gòu)過程[7]，這提示我們嘗試將離子通道作為有效干預(yù)心室重構(gòu)的新靶點(diǎn)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，在心室重構(gòu)的進(jìn)程中，心肌IK1電流及IK1蛋白表達(dá)都有下調(diào)趨勢[6-7,11]，因此，IK1通道的變化可能涉及心室重構(gòu)的過程，增強(qiáng)IK1可能具有改善心室重構(gòu)的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，IK1選擇性激動劑扎考比利可以改善腹主動脈縮窄后大鼠心功能及心肌纖維化的程度：與模型組相比，扎考比利組大鼠LVSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax顯著升高，而LVEDP 顯著降低；與左心室功能相關(guān)的血漿BNP 和TNF-α 含量也顯著低于模型組；心肌間質(zhì)I型、Ⅲ型膠原沉積及I型/Ⅲ型膠原比例失調(diào)是心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)的主要特征[9]，本研究中，扎考比利預(yù)防性地減少了心肌間質(zhì)I型、Ⅲ型膠原沉積，并且I型/Ⅲ型膠原比值顯著下降，纖維化面積明顯縮小，表明扎考比利可能是通過調(diào)節(jié)心肌間質(zhì)膠原比例來改善心肌纖維化的程度。

氯喹已被證實(shí)對IK1具有很強(qiáng)的阻斷作用[12-13]。前期我們采用高效液相色譜法測定大鼠血漿中氯喹含量，篩選出7.5 μg/（kg·d）是大鼠腹腔給藥的最佳劑量，其濃度可以特異性阻斷IK1[9]。為了進(jìn)一步證實(shí)扎考比利改善心功能、抗心肌纖維化的作用是通過激動IK1來發(fā)揮作用，我們在本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了扎考比利+氯喹組。通過氯喹聯(lián)合扎考比利共同給藥，我們觀察到，氯喹明顯阻斷了扎考比利對腹主動脈縮窄后心功能及心肌纖維化的改善作用。

與心肌纖維化及心室重構(gòu)關(guān)系密切的TGF-β1在心血管系統(tǒng)中表達(dá)廣泛。TGF-β1通過與受體結(jié)合將信號傳導(dǎo)至下游的 Smads 家族，Smads 介導(dǎo)了TGF-β1的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中Smad3 促進(jìn)纖維化的形成，Smad7 卻是主要的抑制性蛋白[14]，它們與心肌纖維化、心力衰竭、心肌梗死、血管創(chuàng)傷、肺動脈高壓等心血管疾病有關(guān)系[15]。對于扎考比利改善腹主動脈縮窄后心功能及心肌纖維化程度的作用機(jī)制，本研究測定了各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3 和Smad7 mRNA 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，扎考比利組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)明顯減少，Smad7 mRNA 表達(dá)明顯升高，故扎考比利抗心肌纖維化的作用可能與TGF-β1/Smads信號通路有關(guān)。

本研究證實(shí)，扎考比利能夠明顯改善腹主動脈縮窄后大鼠的心功能與心肌纖維化程度。這將為IK1作為改善心室重構(gòu)的新藥物作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。