鄭勤妮　楊通華　莊麗　萬永虎　任麗娟　付林　李世軍　唐光鵬

【摘 要】目的：分析2012-2014年貴州省流感病毒活動規(guī)律，為貴州省的流感防控工作提供科學依據(jù)。方法：采集全省12家國家級哨點醫(yī)院流感樣病例患者的鼻咽拭子。利用實時熒光定量PCR（real-timePCR）方法進行檢測分析，用MDCK細胞進行病毒分離培養(yǎng)。結(jié)果：（1）RT-PCR結(jié)果對33473份流感樣病例咽拭子進行核酸檢測，檢出陽性標本3783份，檢出率為11.30%，其中B型Yamagata系（BY）677份，B型Victoria系（BV）471份，B型混合型26份，A（H1N1）亞型908份，A（H3N2）亞型1690份。2012年BV和A（H3N2）同時共存，分別占總陽性率的48.21%和49.44%。2013年BY、A（H1N1）和A（H3N2）同時共存，分別占總陽性率的31.39%、48.91%和19.48，以A（H1N1）占優(yōu)勢。2014年以A（H3N2）占絕對優(yōu)勢，陽性率為65.27%。（2）MDCK細胞分離結(jié)果對1616份陽性標本進行病毒培養(yǎng)，分離出毒株923株，分離率為57.12%。其中，BY、BV、A（H1N1）H和A（H3N2）亞型分別占13.24%、8.72%、14.36%和20.79%。結(jié)論：貴州省2012-2014年流感病毒呈交替流行，這提示應注意基因頻繁交替變異新毒株的出現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】流感病毒;監(jiān)測;MDCK細胞;RT-PCR

【中圖分類號】R373.13【文獻標識碼】A【文章編號】1672-3783（2019）12-03--01

流行性感冒病毒（influence virus）簡稱流感病毒，可引起急性呼吸道傳染病-流行性感冒（簡稱流感）。流感為第一個實行全球性監(jiān)測的傳染病，同時也是至今無法完全加以控制的一種病毒性急性呼吸道傳染病[1]。流感病毒屬于正粘病毒科，為單股、負鏈、分節(jié)段RNA病毒，分為甲（A）、乙（B）和丙（C）三型。流感病毒表面抗原HA和NA容易發(fā)生變異，導致每年季節(jié)性流感和偶爾流感大流行的發(fā)生，在全球范圍內(nèi)導致一定的經(jīng)濟和健康負擔[2-4]，流感并發(fā)癥可引起年老體弱者一定的死亡率[2，5，6]。1957年2月貴州省首發(fā)甲2（H2N2）亞型流感病毒，被稱之為亞洲流感病毒[7]，為了更好地了解貴州省流感病毒活動的特征，本文對2012-2014年間貴州省流感病毒的活動規(guī)律進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源

標本來自貴州省9個市（州）疾病預防控制中心流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室及12家哨點醫(yī)院。依據(jù)《全國流感監(jiān)測技術(shù)指南》在哨點醫(yī)院呼吸內(nèi)科、兒科、急診科采集發(fā)熱3d或3d之內(nèi)未服用抗病毒藥物的流感樣病例患者的鼻咽拭子，采集對象為發(fā)熱、腋下體溫≥38℃，伴有咳嗽或咽喉疼痛之一。

1.1.2 MDCK細胞系 MDCK細胞均由中國疾病預防控制中心病毒病所提供。

1.1.3 主要試劑 改良的1640培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺）（CatNo.11965）;青、鏈霉素母液（10000U/mL青霉素G;10000?g/mL硫酸鏈霉素，CatNo.SV30010）;TPCK-胰酶（牛胰腺來源Ⅷ型）;胎牛血清（CatNo.16000）均購自美國GIBCO公司;EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na，CatNo.25300）;Hepes緩沖液，1M母液 （CatNo.SH30237.01）;0.75%牛血清白蛋白組分V（CatNo.RS0007）;Na2HCO3（CatNo.SH30033.01）均購自美國Hyclone公司;1M的PBS液購自美國GIBCO公司，1.5%豚鼠血，核酸提取試劑盒。

1.1.4 主要儀器 生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司;倒置顯微鏡（EVOS）購自美國Life Technologies公司;熒光定量PCR儀（ABI7500）購自美國ABI公司;低溫離心機購自美國SIGMA公司;4℃冰箱和-80℃超低溫冰箱購自中國青島Haier公司。

1.2 方法

1.2.1 標本的處理 所采集的標本經(jīng)震蕩20min混均后，吸取200ul樣品進行病毒核酸的提取，剩余的樣品中加入5%的雙抗4℃處理4小時或者過夜，以備MDCK細胞分離用。

1.2.2 MDCK細胞培養(yǎng) 參照全國流感方案操作。

1.2.3 病毒核酸提取 提取試劑盒為德國QIAGEN公司的The RNeasy Mini Kit（50），具體操作步驟見試劑盒說明書。

1.2.4 Real-Time PCR擴增 （達安試劑盒），具體方法見試劑盒說明書。

1.2.5 病毒分離培養(yǎng) 吸取1mL經(jīng)PCR檢測陽性的雙抗處理好的標本，接種到生長狀態(tài)和形態(tài)均良好的MDCK細胞單層上，于35℃孵育1.5h，棄去標本液，PBS洗細胞兩遍，加入5mL病毒生長液，于35℃培養(yǎng)，24h時開始每日觀察細胞病變，24h內(nèi)病變的細胞屬非特異性病變，達到90-100%的細胞脫落時收獲病毒培養(yǎng)液。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR監(jiān)測結(jié)果

2012-2014年貴州省共檢測流感樣病例標本33473份，RT-PCR核酸檢測陽性3783份，陽性率為11.30%。其中，BY 亞型677份，占17.90%，BV亞型471份，占12.54%，混合型23份，占0.69%，A（H1N1）亞型908份，占24.00%，A（H3N2）亞型483份，占44.67%。2012年共檢測標本數(shù)為6829份，檢出核酸陽性977份，陽性率為14.31%。其中，BV和A（H3N2）亞型分別為471、483份， 占48.21%和49.44%，為兩種病毒同時共存，并檢出23份混合毒株。2013年共檢測標本數(shù)為12138份，檢出核酸陽性1335份，陽性率為11%。BY、A（H1N1）和A（H3N2）亞型分別為419、653和260份， 占31.39%、48.91%和19.48%，為三種病毒共存，其中A（H1N1）占優(yōu)勢毒株，檢測到3株混合型。2014年共檢測標本數(shù)為14506份，檢出核酸陽性1451份，陽性率為10%。BY、A（H1N1）和A（H3N2）亞型共存，A（H3N2）亞型947份，占65.27%，占絕對優(yōu)勢毒株。

2.2 流感病毒MDCK細胞分離結(jié)果 2012-2014年貴州省共檢測核酸陽性標本3853份，對1616份標本進行了流感病毒的分離培養(yǎng)（由各個網(wǎng)絡實驗室進行分離），分離到流感病毒923株，分離率為57.12%，其中214株BY亞型，141株BV亞型，232株A（H1N1）亞型，336株（AH3N2）亞型。2012年分離BV亞型毒株141株，分離率為20.17%，成為主要毒株。2013年分離BY和A（H1N1）亞型毒株分別為154、174株，分離率為33.45%和38.93%。2014年分離A（H3N3）亞型毒株261株，分離率為55.53%。

3 討論

流感病毒的變異與流感的暴發(fā)和流行密切相關(guān)，流感病毒正是通過不斷改變其抗原性來逃逸宿主的特異性免疫識別和清除，從而引起流行[8]。2012-2014年貴州省流感病毒監(jiān)測核酸結(jié)果提示，貴州省在這三年間檢出BY、BV、A（H1N1） 和A（H3N2）流感病毒，這與全國流感監(jiān)測結(jié)果一致。2012年 BV和A（H3N2）亞型分別占陽性率的48.21%和49.44%，為兩種病毒同時共存，BV占48.21%的陽性率，呈現(xiàn)一個流行高峰，這與2011年B型流感病毒在我國局部地區(qū)小規(guī)模的爆發(fā)相符[8]。2013-2014年BV消失，且2013年A（H3N2）亞型的檢出率下降，這可能與流行高峰后人們對流感病毒有一定的免疫力有關(guān)。相反2013年BY和A （H1N1）的檢出率升高，分別占陽性率的31.39%和48.91%，這可能與流感病毒通過不斷改變抗原性來逃脫宿主的免疫有關(guān)[7]。2014年A（H3N2）亞型流感病毒又呈現(xiàn)出明顯升高的趨勢，2014年檢出A（H3N2）亞型流感病毒947份，占陽性率的65.27%，成為絕對優(yōu)勢毒株。由此表明，2012-2014年間，貴州省流感病毒的流行特征為各亞型毒株交替出現(xiàn)。其中值得注意的是A（H3N2）亞型流感病毒在這三年間均與其余亞型共存，2012和2014年均以優(yōu)勢毒株出現(xiàn)，這就提示我們在警惕流感病毒基因頻繁變異下新毒株出現(xiàn)的同時，還應注重A（H3N2）亞型流感病毒的防控。

組織細胞培養(yǎng)法分離流感病毒是流感實驗室診斷的“金標準”[7]。該方法不受流感病毒株抗原變化影響，能監(jiān)測新的流行的流感病毒亞型出現(xiàn)，為新一代流感疫苗的制備提供依據(jù)。流感病毒組織細胞分離陽性率與實驗室能力、流感病毒流行強度、病毒型別和接種標本盲傳代次有關(guān)，2012-2014年貴州省流感病毒細胞分離陽性率與核酸檢測陽性率相符。RT-PCR核酸檢測和細胞分離結(jié)果顯示，2012年細胞分離BV系141株，占20.17%。這與2011年BV流行有關(guān)，而A（H3N2）分離率低，可能與實驗室能力有關(guān)。2013年細胞分離BY系154株，占33.45%，A（H1N1）亞型174株，占38.93%，這與核酸檢測的結(jié)果相符。2014年細胞分離A（H3N2）亞型265株，占55.53%，與核酸檢測結(jié)果相符合。2012-2014年間細胞分離毒株數(shù)與上毒陽性標本數(shù)呈反相關(guān)，這可能主要與實驗室能力和接種標本盲傳代次有關(guān)。細胞分離方法是用于流感病毒的分離、培養(yǎng)的常規(guī)方法。因此，穩(wěn)定實驗室檢測隊伍，加強質(zhì)量控制，規(guī)范操作和增加標本盲傳代數(shù)是提高細胞分離流感病毒的保障。

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