鄧秀玲 扈瑞平 李薇

【摘要】目的：研究蒙藥壯西-21對(duì)體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法：采用不同濃度蒙藥處理細(xì)胞后，通過(guò)MTT法檢測(cè)該藥對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變。結(jié)果：MTT顯示，蒙藥壯西-21能抑制人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈現(xiàn)濃度依賴性;熒光鏡下可見(jiàn)藥物作用后，胃癌細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變。結(jié)論：蒙藥壯西-21對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】壯西-21;胃癌;生長(zhǎng)抑制

【中圖分類(lèi)號(hào)】R29【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）8-0033-03

Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofMongoliadrugzhuangxi-21ongrowthofgastriccancercellsinvitro.MethodsMTTassaywasusedtodetectthegrowtheffectofzhuangxi-21ongastriccells，andthecellmorphologicchangeswasobservedbyfluorescencemicroscope.ResultsMTTassayshowedzhuangxi-21hasasignificantinhibitoryeffectontheproliferationofgastriccancercells，anditsinhibitoryeffectisenhancedwiththeincreaseofconcentration;morphologicchangesofapoptosiswereobservedbyfluorescencemicroscope.Conclusionzhuangxi-21hassignificantinhibitionofproliferationforgastriccancercellsinvitro.

Keywords：Zhuangxi-21;GastricCancerCells;GrowthInhibition

在我國(guó)胃癌的發(fā)病率居各種惡性腫瘤的第二位，其異質(zhì)性強(qiáng)，預(yù)后較差。目前對(duì)于胃癌的治療主要采用手術(shù)、化療和放療三大手段，臨床上常用的化療和放療藥物，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也給人體帶來(lái)不同程度地?fù)p傷或不良反應(yīng)[1]。臨床實(shí)踐表明，蒙藥在抗腫瘤方面有一定的優(yōu)勢(shì)，如藥理作用廣泛，不良反應(yīng)小，不易產(chǎn)生耐藥性等[2]。

蒙藥壯西-21（以下簡(jiǎn)稱壯西）是由寒水石等二十一味藥物組成的復(fù)方藥，臨床主要用于治療消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌等消化系統(tǒng)疾病[3-5]。壯西抗腫瘤作用主要來(lái)自臨床實(shí)踐中，雖然療效確切，但無(wú)進(jìn)一步研究，特別是鮮見(jiàn)有從細(xì)胞、分子水平研究其作用機(jī)制的報(bào)道。本研究以體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞為對(duì)象，觀察復(fù)方蒙藥壯西對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1材料和方法

1.1試劑和儀器蒙藥壯西（內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)院），用PBS配成50mg/mL貯液，過(guò)濾除菌4℃保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。胃癌MGC-803細(xì)胞（北京腫瘤研究所提供），培養(yǎng)基DMEM（Gibco公司），胎牛血清（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所），紫杉醇（四川太極制藥有限公司），Hochest33342、碘化丙啶（PI）、塞唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）（Sigama公司）。酶標(biāo)儀（日本550型），CO2恒溫孵育箱（美國(guó)NAPCO），熒光顯微鏡（日本，NIKON）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將胃癌MGC-803細(xì)胞置于含10%胎牛血清、80u/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃含5%濕飽和CO2溫箱中，常規(guī)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞的活力實(shí)驗(yàn)MTT法，將培養(yǎng)的細(xì)胞調(diào)整濃度為3×104個(gè)/mL，接種于96孔板上，每孔0.2mL，培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)液，分別加入蒙藥壯西，使終濃度分別為：2.5、1.25、0.63、0.31、0.15mg/mL。另設(shè)陰性對(duì)照組（不加藥）、空白對(duì)照組（無(wú)細(xì)胞和藥）、陽(yáng)性對(duì)照組（紫杉醇處理組）其作用終濃度為10-6mol/L，各組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。以上各組總體積均為200μL。培養(yǎng)72h，每孔加入20μL5%MTT，37℃溫育4h，棄培養(yǎng)液加DMSO200μL，振蕩10min，酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處吸光度OD值。按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

抑制率=（對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值）/（對(duì)照組平均OD值-空白組平均OD值）×100%

1.4細(xì)胞形態(tài)觀察：壯西作用細(xì)胞48h后，采用熒光雙染法觀察細(xì)胞形態(tài)變化。取1×106個(gè)細(xì)胞離心，經(jīng)PBS洗滌2次，重懸于200μLPBS中，分別加25μL熒光染料Hoechst33342和PI。37℃溫育8～10min，離心洗滌后滴片，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1壯西對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用壯西對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，其生長(zhǎng)抑制率隨濃度的增加而升高，呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢(shì)。壯西對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的最高抑制率達(dá)84.87%，高于陽(yáng)性對(duì)照組紫杉醇的抑制率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2壯西對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響倒置光顯微鏡下觀察到，正常培養(yǎng)的對(duì)照組細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，大小均勻，核圓居中，胞質(zhì)清亮透明。2.5mg/mL蒙藥處理組作用48h后，部分細(xì)胞失去正常生長(zhǎng)形態(tài)，細(xì)胞變小變圓，胞質(zhì)亮度下降，胞膜皺縮、內(nèi)陷;隨著時(shí)間推移，細(xì)胞形狀不規(guī)則，最后破碎壞死。熒光鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞被Hoechst33342染色后，發(fā)出均勻的藍(lán)色熒光，大小一致，提示為正?；罴?xì)胞;2.5mg/mL處理組部分細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的顆粒狀或塊狀熒光，提示為細(xì)胞染色質(zhì)凝集、核固縮或核碎裂，為凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變。此外，鏡下見(jiàn)壞死細(xì)胞被PI紅染。如圖1所示。

3討論

細(xì)胞異常增殖和分化與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤治療的一個(gè)基本問(wèn)題是如何抑制腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖能力。蒙藥壯西-21，漢名為寒水石二十一味散，由寒水石、蓽撥、訶子、石榴、瞿麥、沙棘、五靈脂、砂仁、紫花地丁、木鱉子、人工牛黃、連翹、木香、降香、麥冬等二十一味藥物組成，其藥理作用是調(diào)體內(nèi)“赫依”“希拉”“巴達(dá)干”三根，具有保護(hù)消化道黏膜、抑制胃酸分泌的作用。組方中寒水石、蓽撥、五靈脂均具有抗腫瘤的作用[6]，但單體成分或提取物并不能反映蒙藥復(fù)方的廣泛藥理作用及蒙醫(yī)理論，而且蒙藥的臨床應(yīng)用主要以復(fù)方制劑為主。為從細(xì)胞水平揭示蒙藥壯西的抗腫瘤作用，本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞為對(duì)象，觀察復(fù)方蒙藥壯西對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

MTT法是目前檢測(cè)藥物在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用常用的方法之一，其原理是利用活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞內(nèi)將MTT氧化為藍(lán)紫色甲臜晶體，沉積于細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，了解細(xì)胞的存活情況，而死細(xì)胞則不能氧化MTT。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法觀察不同濃度的蒙藥壯西組對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明壯西在體外能顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，尤以高濃度組的抑制率最高，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴的趨勢(shì)。2.5mg/mL藥物處理后對(duì)細(xì)胞的抑制率超過(guò)了紫杉醇組的抑制率。倒置光顯微鏡下見(jiàn)，蒙藥作用后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變。采用熒光雙染法對(duì)胃癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞經(jīng)壯西作用后，部分細(xì)胞核凝集、碎裂成片狀，呈凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變，還有部分細(xì)胞趨向壞死的改變，表明該藥在體外對(duì)胃癌細(xì)胞發(fā)揮生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)制之一，可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。組方中的主藥寒水石在蒙醫(yī)中有不同的炮制方法，可用于治療不同的病癥[7]。其中寒水石與與訶子、硼砂、光明鹽、蓽茇、麥冬組成灰化小劑，趙立遠(yuǎn)等[8]研究發(fā)現(xiàn)該化灰小劑可抑制S-180荷瘤小鼠的腫瘤的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也初步觀察到了壯西有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)僅觀察了蒙藥對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷的生物學(xué)效應(yīng)，其具體的作用機(jī)理尚需深入研究。

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（收稿日期：2019-02-18編輯：程鵬飛）