彭玉萌 霍光華 譚明輝 陳緒濤 肖大瑾

摘要：探索無(wú)患子抗稻瘟病病菌的活性成分，運(yùn)用大孔吸附樹(shù)脂及硅膠柱層析對(duì)無(wú)患子皂苷進(jìn)行分離純化，采用薄層色譜法和高效液相色譜法定性、光度比色法定量、核磁共振和質(zhì)譜法確定結(jié)構(gòu)、瓊脂稀釋法評(píng)價(jià)抗稻瘟病病菌活性。結(jié)果顯示，無(wú)患子提取物過(guò)D101大孔吸附樹(shù)脂的70%乙醇洗脫液，再經(jīng)過(guò)硅膠柱，收集到由三氯甲烷-甲醇（體積比分別為1 ∶ 1、3 ∶ 1、5 ∶ 1、7 ∶ 1、9 ∶ 1）洗脫下來(lái)的5個(gè)活性組分，該5個(gè)組分的抗稻瘟病病菌EC50分別為46.84、5119、23.13、29.92、40.85 μg/mL。進(jìn)一步純化7 ∶ 1、5 ∶ 1流分，分別獲得1個(gè)單體成分和含有2種成分的混合物，在濃度為20 μg/mL時(shí)，抗菌率分別為84.16%、81.24%。該單體結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜分析和文獻(xiàn)比對(duì)被鑒定為常春藤3-O-α-D-木吡喃糖基（1→3）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

關(guān)鍵詞：無(wú)患子;皂苷;分離;抗稻瘟病病菌活性

中圖分類號(hào)： S435.111.4+1;S482.2+92? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0127-04

無(wú)患子（Sapindus mukorossi）正如其名的含義“無(wú)病之果”，該植物有著廣泛的藥用價(jià)值，果實(shí)可治療過(guò)度流涎、丘疹、癲癇、萎黃病、偏頭痛、濕疹、牛皮癬等，種子粉可治療齲齒、關(guān)節(jié)炎、普通感冒、便秘、作嘔等，種子可去皮膚黃褐色和雀斑、清洗皮膚油性分泌物、制洗發(fā)劑等，葉可用于浴池減緩關(guān)節(jié)痛，根可治療痛風(fēng)、風(fēng)濕病等[1]。已發(fā)現(xiàn)無(wú)患子提取物具有抑制光滑念珠菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌[2]、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、幽門(mén)螺旋桿菌等細(xì)菌的活性，而且幽門(mén)螺旋桿菌等菌不會(huì)對(duì)該提取物產(chǎn)生抗性[3]，還可以抑制黑曲霉[4]、苜宿炭腐病病菌和黃連白絹病病菌（EC50為181～407 μg/mL）[5]等的活性。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)患子中果皮總皂苷提取物具有強(qiáng)烈抑制稻瘟病病菌的活性，而無(wú)患子皂苷種類豐富，其中果實(shí)中含有13種五環(huán)三萜類齊墩果烷型皂苷[5-9]，根中含有2種五環(huán)三萜類甘遂烷型皂苷[10-11]，蟲(chóng)癭中含有7種達(dá)瑪烷型皂苷和5種甘遂烷型皂苷[12-13]，而且新的皂苷還在不斷地被發(fā)現(xiàn)[14]。為了尋覓其生防活性皂苷先導(dǎo)物，本試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行分離探索，并進(jìn)行色譜光譜定性定量分析以及活性跟蹤。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

本試驗(yàn)于2017年在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省菌物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。無(wú)患子中果皮浸膏由南昌市生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備[15]。

GF254薄層硅膠板，購(gòu)自山東省煙臺(tái)市芝罘化工廠;D101型大孔樹(shù)脂，購(gòu)自天津市南開(kāi)大學(xué)化工廠;柱層析用硅膠（精致型），購(gòu)自青島海洋化工廠分廠。高效液相色譜儀，購(gòu)自Waters公司;核磁共振波譜儀，400 MHz NMR波譜儀，購(gòu)自Bruker公司;UPLC-ESI-QTOF質(zhì)譜儀，購(gòu)自安捷倫科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大孔吸附樹(shù)脂初分無(wú)患子抗稻瘟病病菌活性成分 醇洗脫梯度的選擇：吸取15 mL無(wú)患子浸膏的正丁醇萃取物，緩慢上樣至D101型大孔吸附樹(shù)脂柱中，依次用2倍柱體積（BV）的體積分?jǐn)?shù)為0、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液過(guò)柱，流速為2 mL/min，收集各流分。分別測(cè)定各流分的皂苷含量、固形物含量以及抗稻瘟病病菌活性。

洗脫劑用量的確定：吸取15 mL正丁醇萃取物，緩慢上樣至D101型大孔吸附樹(shù)脂柱中，依次用蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各4 BV洗脫。以1 BV/份收集流分，測(cè)定各流分中固形物含量和無(wú)患子皂苷的含量。

1.2.2 硅膠柱色譜分離無(wú)患子抗稻瘟活性成分 稱取90 g 200～300目的硅膠，用三氯甲烷浸泡24 h后，濕法裝柱。量取10 mL經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂洗脫的70%流分，分別按三氯甲烷、甲醇體積比為9 ∶ 1、7 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度2 BV，每50 mL洗脫液收集1份。蒸干后，測(cè)定各洗脫流分在濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)稻瘟病病菌的抑菌活性。

1.2.3 皂苷成分分析及波譜數(shù)據(jù)測(cè)定 薄層色譜分析（TLC）檢測(cè)：將過(guò)硅膠柱后的各流分用毛細(xì)管點(diǎn)樣于薄層板上，點(diǎn)樣后用吹風(fēng)機(jī)吹干，然后放入加有三氯甲烷和甲醇體積比為7 ∶ 3的展開(kāi)劑層析缸中，封上蓋子，待展開(kāi)至距離薄層板頂端1 cm左右時(shí)取出，用吹風(fēng)機(jī)吹干，然后噴上10% H2SO4溶液，加熱顯色。

高效液相色譜分析（HPLC）檢測(cè)：將過(guò)硅膠柱后的各流分減壓濃縮，冷凍干燥至干，分別稱取少量樣品，用色譜純級(jí)的甲醇溶解，過(guò)0.45 μm濾膜，然后以乙腈和水為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)無(wú)患子皂苷的純度。色譜柱為C18柱，4.6 mm×150 mm;柱溫為25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm;流動(dòng)相：A泵是乙腈，B泵是水。梯度洗脫程序?yàn)?～5 min，30% A;5～6 min，30%～50% A;6～40 min，50%～70% A;40～60 min，70%～100% A。流速為2 mL/min;進(jìn)樣量為20 μL。

核磁譜圖在Bruker公司400 MHz NMR波譜儀上測(cè)定，以四甲基硅為內(nèi)標(biāo)物，化學(xué)位移單位為10-6，耦合常數(shù)單位為Hz。

1.2.4 皂苷含量的定量分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取 10.0 mg 干燥的齊墩果酸，用甲醇溶解并定容至10 mL，備用;稱取0.500 0 g香草醛，用冰乙酸溶解并定容至10 mL，備用;分別吸取齊墩果酸甲醇溶液0、40、80、120、160、200、240 μL于比色管中，每組3次重復(fù)，水浴加熱揮去溶劑，先后加入 0.4 mL 配好的香草醛-冰醋酸溶液，1.4 mL高氯酸（氧化劑），充分搖勻，于70 ℃水浴加熱20 min，取出后立即浸入冰水浴中冷卻2～3 min，加入10 mL冰乙酸，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度[16]。用移液槍吸取一定體積的分離液，測(cè)定樣品分離液的吸光度（用標(biāo)準(zhǔn)曲線法），以不加提取液為空白對(duì)照，計(jì)算提取液中的皂苷含量。

1.2.5 抗稻瘟病病菌活性測(cè)定 將水稻稻瘟病病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，備用。用直徑為7 mm的打孔器打取菌落邊緣的菌塊作為接種物，分別接種預(yù)先制備的含不同濃度無(wú)患子皂苷的PDA平板上，每個(gè)處理3次重復(fù)，培養(yǎng)7 d后采用十字交叉法測(cè)定菌落大小，并算出抑菌率：

抑菌率=（空白菌落直徑-含藥菌落直徑）/（空白菌落直徑-接入菌塊直徑）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)無(wú)患子皂苷的初步分離效果

2.1.1 不同濃度乙醇水溶液的洗脫分離效果 由表1可知，無(wú)患子粗皂苷經(jīng)D101大孔吸附樹(shù)脂分離后，其皂苷主要集中于70%、50%、95%乙醇洗脫液中，蒸餾水和30%乙醇洗脫液中雖然有一定的固形物存在，但并未檢測(cè)出皂苷，這說(shuō)明其中的固形物有可能是糖類等水溶性雜質(zhì)。因此，蒸餾水和低濃度乙醇可以用來(lái)除掉無(wú)患子粗皂苷中的雜質(zhì)。

2.1.2 洗脫劑用量對(duì)分離效果的影響 由表2可知，在用 3 BV 的蒸餾水洗脫時(shí)，已經(jīng)能將萃取物中的水溶性雜質(zhì)除盡，再繼續(xù)用蒸餾水洗脫，則沒(méi)有物質(zhì)被洗脫下來(lái);30%乙醇洗脫用量至3 BV時(shí)，在流分中未檢測(cè)到無(wú)患子皂苷，當(dāng)用量達(dá)到4 BV時(shí)，開(kāi)始有無(wú)患子皂苷，說(shuō)明無(wú)患子皂苷隨著30%乙醇用量的增加，已有部分被解吸，因此，30%乙醇的用量確定為3 BV;當(dāng)70%乙醇的用量為4 BV時(shí)，已經(jīng)能夠洗下所有皂苷。因此，選擇D101大孔吸附樹(shù)脂純化無(wú)患子皂苷的工藝為蒸餾水和30%乙醇各3 BV，70%乙醇4 BV，依次洗脫，收集70%乙醇洗脫液。由表3可計(jì)算出，70%乙醇流分抗稻瘟病病菌的毒力方程為y=2.220 0x+1.390 8（r2=0.987 2，P=0.001 7），EC50=42.245 4 μg/mL，EC90=159.610 0 μg/mL。

2.2 硅膠柱色譜對(duì)無(wú)患子皂苷的分離效果

2.2.1 硅膠柱不同比例二元洗脫劑洗脫的無(wú)患子皂苷流分的抗稻瘟病病菌活性 由表4可知，三氯甲烷與甲醇二元洗脫劑的體積比為5 ∶ 1、7 ∶ 1時(shí)，其EC50較小，分別為 23.132 5、29.918 7 μg/mL，而其他體積比的EC50均高于 40 μg/mL，說(shuō)明主要活性物質(zhì)可能在這2個(gè)流分中。另一方面，EC90似乎表現(xiàn)出極性越弱的流分活性越強(qiáng)的趨勢(shì)，即含糖基越少的無(wú)患子皂苷活性越強(qiáng)。

2.2.2 硅膠柱不同比例二元洗脫劑洗脫的無(wú)患子皂苷流分的色譜結(jié)果 由圖1可知，大孔吸附樹(shù)脂70%乙醇流分所含皂苷成分較多，至少有5個(gè)化合物。經(jīng)過(guò)硅膠柱層析，各比例三氯甲烷和甲醇洗脫后，能夠得到有效分離。1 ∶ 1和3 ∶ 1流分似乎成分相對(duì)單一，但活性較弱，而活性較強(qiáng)的5 ∶ 1流分似有3個(gè)成分，7 ∶ 1、9 ∶ 1流分均有2個(gè)以上化合物。

2.2.3 無(wú)患子皂苷的純化及其抗稻瘟病菌活性 向5 ∶ 1流分的三氯甲烷-甲醇溶液中加入蒸餾水，有白色絮狀物出現(xiàn)，離心收集白色絮狀物，棄去上清液，獲得了白色粉末狀成分，經(jīng)色譜純甲醇溶解沉淀，HPLC檢測(cè)，獲得了含有2個(gè)主峰的混合物A（圖2-a）。將7 ∶ 1流分重新上硅膠柱，進(jìn)一步細(xì)分三氯甲烷和甲醇的比例，得到了白色晶體狀物質(zhì)，經(jīng)HPLC檢測(cè)，獲得1個(gè)單體化合物B（圖2-b）。2個(gè)物質(zhì)在濃度為 20 μg/mL 時(shí)，對(duì)稻瘟病病菌的抑制率分別為81.24%（圖2-c）、84.16%（圖2-d）。

2.3 活性無(wú)患子皂苷的鑒定

活性無(wú)患子皂苷單體的結(jié)構(gòu)式如圖3所示，為白色晶狀單體。1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ 0.73，0.84，0.93，0.96，0.99，1.20（3H，each，all s，24，26，29，30，25，27-H3），1.63（1H，m，9-H），1.90（1H，m，11-H），2.86（1H，dd，J=17.03，9.30 Hz，18-H），3.28，3.22（2H，both d，J=11.03，23-H2），3.64（1H，dd，J=6.32，4.10 Hz，3-H），4.47（1H，d，J=7.2 Hz，1″-H），4.50（1H，d，J=6.88 Hz，1′-H），5.16（1H，t，12-H），5.22（1H，brs，s，1″-H）。13C-NMR（101 MHz，MeOD）δ 182.31，145.21，123.26，106.34，104.51，101.16，82.11，81.92，77.42，76.00，75.04，74.01，72.73，71.43，70.87，69.72，69.65，66.94，65.31，64.39，47.95，47.93，47.55，47.13，43.76，42.79，42.59，40.30，39.47，37.42，34.76，33.7，33.41，33.22，31.42，28.67，26.38，26.27，24.32，23.91，23.82，18.62，17.84，17.81，16.20，13.60。HR-ESI-MS：m/z 882.497 7[M+H]+（calcd for C46H74O16，882.497 7）。與文獻(xiàn)比對(duì)該單體的結(jié)構(gòu)被確定為常春藤3-O-α-D-木吡喃糖基（1→3）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

3 結(jié)論

無(wú)患子中果皮總皂苷浸膏正丁醇溶出物經(jīng) D101 大孔樹(shù)

脂的70%乙醇水溶液洗脫，洗脫物再經(jīng)硅膠柱層析，分別收集三氯甲烷和甲醇體積比為5 ∶ 1、7 ∶ 1的流分，前者水洗后離心析出的白色粉末狀為含2個(gè)成分的混合物，后者進(jìn)一步過(guò)硅膠柱，細(xì)分二元洗脫劑流分，獲得白色晶狀單體。這2個(gè)成分的混合物和單體在濃度為20 μg/mL時(shí)，抗菌率分別為81.24%、84.16%。經(jīng)鑒定，該單體無(wú)患子皂苷結(jié)構(gòu)為常春藤3-O-α-D-木吡喃糖基（1→3）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。該皂苷成分為無(wú)患子抗稻瘟病菌活性先導(dǎo)物之一。

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