劉新國，黃文濤

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

白芥子涂方用于防治肺系疾病，始見于清代張璐編撰的《張氏醫(yī)通》，該方在防治哮喘方面有較好療效，目前被各大醫(yī)院廣泛采用[1]。傳統(tǒng)白芥子涂方以藥材粉末入藥，不僅成分含量不可控，且由于藥材本身質(zhì)量差異以及患者皮膚耐受程度差別，使得貼敷時(shí)間一般只能維持2～6 h[2-3]，有悖于經(jīng)皮給藥制劑質(zhì)量可控、緩釋長效的要求。目前，筆者尚未見基于該方開發(fā)的現(xiàn)代膏貼劑型。筆者在系統(tǒng)比較軟膏劑、黑膏藥等膏貼劑型特點(diǎn)基礎(chǔ)上，配制具有乳化性質(zhì)的硬膏劑基質(zhì)。該基質(zhì)與其他外用膏貼基質(zhì)相比，在載藥量、乳化性能、藥物兼容性、透皮能力、穩(wěn)定性方面均具有明顯優(yōu)勢。筆者在研究中首先采用乙醇回流提取與現(xiàn)代超臨界二氧化碳(CO2)萃取技術(shù)實(shí)現(xiàn)藥材有效成分的濃度富集與純化，再結(jié)合乳化型膏貼透皮劑型，將此傳統(tǒng)經(jīng)典方藥開發(fā)成治療哮喘的新型中藥膏貼劑型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 SPD-10A型二元泵高效液相色譜儀，配Essentia SPD-16型紫外檢測器(島津公司)； ME215s型分析天平(Sartorious公司，感量：0.01 mg)；HS6510D型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品(批號(hào)：111702-201303，含量：98.3%)、大戟二烯醇對(duì)照品(批號(hào)：111866-201302，含量：99.9%)、細(xì)辛酯素對(duì)照品(批號(hào)：111889-201203，含量：100%)、延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào)：0726-200208，含量：99.8%)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純(美國Tedia試劑公司生產(chǎn)，批號(hào)：16095012)。水為純凈水，其他試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

2.1.1芥子堿硫氰酸鹽含量測定色譜條件 色譜柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.08 mol·L-1磷酸二氫鉀(10：90)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：326 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃，理論塔板數(shù)按芥子堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.1.2大戟二烯醇含量測定色譜條件 色譜柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(95：5)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃，理論板數(shù)按大戟二烯醇峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

2.1.3細(xì)辛脂素測定色譜條件 色譜柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.2%醋酸溶液(48：52)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：287 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：室溫，理論板數(shù)按細(xì)辛脂素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[4]。

2.1.4延胡索乙素測定色譜條件 色譜柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(40：60)，用三乙胺調(diào)pH值6.5；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃，理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[5]。

2.2溶液的配制

2.2.1對(duì)照品貯備溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品、大戟二烯醇對(duì)照品各適量，分別置于不同量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成芥子堿硫氰酸鹽496 μg·mL-1和大戟二烯醇163 μg·mL-1對(duì)照品貯備溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密量取各回流提取樣品1 mL，甲醇定容至5 mL量瓶，搖勻，以孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 取除受試藥材以外的藥材，按回流提取方法操作，精密量取提取液樣品1 mL，甲醇定容至5 mL量瓶，搖勻，以孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即為陰性對(duì)照溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1方法專屬性考察 吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液、芥子堿硫氰酸鹽和大戟二烯醇對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行液相分析，見圖1。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取上述對(duì)照品貯備溶液100，200，400，1000，2000 μL，加甲醇稀釋定容至10 mL，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件平行進(jìn)樣測定3次。以芥子堿硫氰酸鹽、大戟二烯醇進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表1。

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測得芥子堿硫氰酸鹽和大戟二烯醇峰面積的RSD分別為0.28%和0.93%，表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，6，12 h進(jìn)樣測定。經(jīng)計(jì)算，芥子堿硫氰酸鹽和大戟二烯醇峰面積的RSD分別為1.12%和1.57%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.3.5回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取9份已知含量的回流提取液200 μL，分別向其中加入一定量芥子堿硫氰酸鹽或大戟二烯醇對(duì)照品，用流動(dòng)相加至5 mL，混勻，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，以3次平行進(jìn)樣的平均含量計(jì)算加樣回收率，結(jié)果芥子堿硫氰酸鹽平均回收率97.06%，RSD=2.40%，大戟二烯醇平均回收費(fèi)率96.66%，RSD=2.31%。見表2。

2.4白芥子、甘遂回流提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 白芥子、甘遂藥材乙醇回流提取工藝，以白芥子有效成分芥子堿硫氰酸鹽和甘遂有效成分大戟二烯醇的提取量作為考察指標(biāo)，采用《中華人民共和國藥典》2015年版芥子和甘遂藥材品種項(xiàng)下高效液相色譜(HPLC)法測定相關(guān)指標(biāo)成分含量[5]。以乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素，選用L9(34)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選回流提取工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表3。

A.芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.缺芥子的陰性對(duì)照品溶液；D.大戟二烯醇對(duì)照品溶液；E.供試品溶液；F.缺甘遂的陰性對(duì)照品溶液；1.芥子堿硫氰酸鹽；2.大戟二烯醇

圖1 回流提取樣品的高效液相色譜圖

A.sinapine thiocyanate；B.sample solution; C.mustard negative control; D.euphadienol; E.sample solution;F.euphorbia negative control；1.sinapine thiocyanate control；2.euphadienol

Fig.1Highperformanceliquidchromatographforrefluxingsamples

表1 芥子堿硫氰酸鹽與大戟二烯醇線性關(guān)系考察

Tab.1Linearcorrelationofsinapinethiocyanateandeuphadienol

成分線性方程r線性范圍/ng芥子堿硫氰酸鹽Y=7534.6X-25 9880.999 849.2～992大戟二烯醇Y=37 652X-22 3970.999 916.3～326

表2 芥子堿硫氰酸鹽與大戟二烯醇回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2Experimentalresultsontherecoveryofsinapinethiocyanateandeuphadienol

成分樣品量加入量測得量μg回收率/%芥子堿硫氰酸鹽97.874.4166.392.0797.874.4168.795.3097.874.4168.194.4997.899.2195.498.3997.899.2194.497.3897.899.2193.696.5797.8124.0220.298.7197.8124.0219.197.8297.8124.0220.899.19大戟二烯醇24.916.340.394.4824.916.340.796.9324.916.340.998.1624.924.547.692.6524.924.548.696.7324.924.549.299.1824.932.657.198.7724.932.657.399.3924.932.656.697.24

表3 回流提取工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平

Tab.3Factorsandlevelsoforthogonalexperimentforrefluxextractionprocess

水平乙醇濃度(A)/%提取時(shí)間(B)/min溶劑用量(C)/mV提取次數(shù)(D)16060 17127590 1102390120 1133

2.5細(xì)辛和延胡索超臨界CO2萃取工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 細(xì)辛和延胡索超臨界CO2萃取工藝是以延胡索中延胡索乙素以及細(xì)辛中細(xì)辛酯素提取量為考察指標(biāo)，采用《中華人民共和國藥典》2015年版細(xì)辛和延胡索藥材品種項(xiàng)下HPLC法測定相關(guān)指標(biāo)成分含量[5]。以萃取壓力、萃取溫度、夾帶劑用量、萃取時(shí)間為影響因素，選用L9(34)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選超臨界CO2萃取工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表4。

表4 超臨界CO2萃取工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

Tab.4FactorsandlevelsoforthogonalexperimentforsupercriticalCO2extractionprocess

水平萃取壓力(A)/MPa萃取溫度(B)/℃夾帶劑用量(C)/倍萃取時(shí)間(D)/min115401.560225503.090335604.5120

2.6乳化型膏貼基質(zhì)配方的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 成型工藝采用石蠟、單甘酯、凡士林、甘油為中藥膏貼劑型基質(zhì)配料，選擇黏性、軟硬度、熔化性、均勻度等為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選基質(zhì)配制比例，正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表5。

表5 基質(zhì)配比正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

Tab.5Orthogonaldesignofmatrixratio

g

按膏貼基質(zhì)配比正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表實(shí)驗(yàn)，將制成的藥膏制成圓柱狀，再切成圓片狀，將藥膏填充入背襯層的固定圓環(huán)中，使每張膏貼中填充藥膏2 g，直徑約3.6 cm，含生藥材4 g。以下是正交實(shí)驗(yàn)基質(zhì)評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)。①黏性。4分：適中，不粘手；2分：黏性偏強(qiáng)或偏差；0分：無黏性或粘手。②軟硬度。4分：適中，易成形，易壓成片狀；2分：較易成形，但偏硬或偏軟；0分：太硬或太軟，不易成形。③均勻度(肉眼觀察)。4分：顏色均勻一致；2分：比較均勻，但浸膏與基質(zhì)混合略顯不均勻；0分：浸膏與基質(zhì)混合不均勻。④熔化性(45～50 ℃考察48 h)。4分：制成貼劑后，放置恒溫45～50 ℃烘箱中觀察48 h，基質(zhì)不熔化，底襯墊上未見明顯熔化痕跡<1 mm；2分：基質(zhì)少量熔化，底襯墊上熔化痕跡1～2.5 mm；0分：基質(zhì)熔化明顯，底襯墊上熔化痕跡>2.5 mm。⑤載藥量。4分：20%以上；3分：15～20%；2分：10～15%；1分：10%以下。

2.7白芥子和甘遂回流提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按表1設(shè)計(jì)方案分別進(jìn)行回流提取，濾過，測定其中芥子堿硫氰酸鹽和大戟二烯醇含量，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6，各指標(biāo)成分方差分析結(jié)果見表7，8。

結(jié)果顯示，僅乙醇濃度對(duì)白芥子和甘遂提取效果產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)，高濃度乙醇不利于芥子堿溶出。而對(duì)于甘遂的提取而言，溶劑用量是影響結(jié)果的首要因素(P<0.05)，適當(dāng)提高乙醇濃度可以增加大戟二烯醇的溶出。如果考慮將兩種藥材進(jìn)行合并提取，綜合省時(shí)、經(jīng)濟(jì)方面的因素考慮，則應(yīng)選擇乙醇回流提取工藝條件為加13倍量60%乙醇，回流提取1次，每次1 h。

2.8細(xì)辛和延胡索超臨界CO2萃取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按表2設(shè)計(jì)方案分別進(jìn)行超臨界CO2萃取，測定樣品中細(xì)辛脂素和延胡索乙素含量，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9，各指標(biāo)成分方差分析結(jié)果分別見表10，11。

表6 白芥子和甘遂乙醇回流提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.6Orthogonalexperimentresultsofethanolrefluxextractionofwhitemustardseedandeuphorbia

序號(hào)因素石蠟(A)單甘酯(B)凡士林(C)甘油(D)芥子堿硫氰酸鹽大戟二烯醇(μg·mL-1)11111543.1120.021222488.8124.431333489.6128.842123484.7150.752231471.4153.662312448.1146.573132424.3143.583213410.6131.193321393.4138.0K11 521.481 452.031 401.721 407.86K2404.181 370.801 366.881 361.23K31 228.231 331.051 385.281 384.79R293.25120.9834.8546.63K1373.13414.13397.52411.60K2450.77409.12413.10414.32K3412.59413.24425.86410.57R77.655.0128.343.74

表7 白芥子乙醇回流提取方差分析結(jié)果

Tab.7Resultsofvarianceanalysisonethanolrefluxextractionofwhitemustardseed

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值石蠟(A)14 523.992.007 262.0071.69<0.05單甘酯(B)2 535.002.001 267.5012.51>0.05凡士林(C)202.602.00101.301.00>0.05甘油(D)362.342.00181.171.79>0.05

F0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00

表8 甘遂乙醇回流提取方差分析結(jié)果

Tab.8Resultsofvarianceanalysisonethanolrefluxextractionofeuphorbia

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值石蠟(A)1 004.972.00502.48403.20<0.01單甘酯(B)4.772.002.381.91>0.05凡士林(C)134.272.0067.1453.87<0.05甘油(D)2.492.001.251.00>0.05

F0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00

以細(xì)辛脂素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由直觀分析極差R可知影響超臨界CO2的因素大小順序?yàn)椋篈>B>D>C，優(yōu)選條件為A2B1C2D1；以延胡索乙素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由直觀分析極差R可知影響回流的因素大小順序?yàn)锳>D>C>B，選擇A2B2C2D3；從表8和表9結(jié)果可以看出，僅萃取釜壓力對(duì)延胡索和細(xì)辛的提取效果產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。綜合兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定超臨界CO2萃取優(yōu)選工藝條件為：萃取壓力25 Mpa，萃取溫度40 ℃，95%乙醇為夾帶劑，其用量為藥材用量的3倍。

表9 細(xì)辛和延胡索超臨界CO2萃取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.9OrthogonalexperimentresultsofsupercriticalCO2extractionprocessofasarumandcorydalis

序號(hào)因素石蠟(A)單甘酯(B)凡士林(C)甘油(D)細(xì)辛脂素延胡索乙素(μg·mL-1)1111150.040.12122241.841.53133339.242.64212376.257.95223168.553.86231266.152.17313260.443.28321363.150.29332162.647.7K1131.06186.61179.14181.20K2210.86173.44180.71168.26K3186.08167.96168.16178.56R79.7918.6412.5512.94K1124.14141.04142.25141.53K2163.74145.54147.08136.77K3141.07142.38139.62150.65R39.614.507.4613.87

表10 細(xì)辛超臨界CO2萃取的方差分析結(jié)果

Tab.10ResultsofvarianceanalysisonsupercriticalCO2extractionprocessofasarum

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值石蠟(A)1111.972.00555.9935.68<0.05單甘酯(B)61.222.0030.611.96>0.05凡士林(C)31.182.0015.591.00>0.05甘油(D)31.172.0015.581.00

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

表11 延胡索超臨界CO2萃取的方差分析結(jié)果

Tab.11ResultsofvarianceanalysisonsupercriticalCO2extractionprocessofcorydalis

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值石蠟(A)263.272.00131.6374.01<0.05單甘酯(B)3.562.001.781.00凡士林(C)9.552.004.772.68>0.05甘油(D)33.132.0016.579.31>0.05

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

2.9乳化型膏貼基質(zhì)配比的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 乳化型膏貼基質(zhì)配比的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表12，13，綜合評(píng)分方差分析結(jié)果見表14。

表12 乳化型膏貼基質(zhì)配比的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.12Orthogonalexperimentresultsofmatrixratioofemulsionpaste

序號(hào)石蠟(A)單甘酯(B)凡士林(C)甘油(D)g綜合評(píng)分12211142242216328331044223145443112648121476232886413109682112K140363838K240384238K330363034R102124

表13 基質(zhì)配比正交實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)分計(jì)算

Tab.13Comprehensivescoresoforthogonalexperimentonmatrixratio

實(shí)驗(yàn)號(hào)軟硬度黏性均勻度熔化性綜合評(píng)分14(適中)2(太黏)441424(適中)4(適中)441632(太軟)2(不黏)241042(偏軟)4(適中)441452(偏軟)2(太黏)441264(適中)4(適中)241472(偏軟)2(太黏)22882(偏硬)2(不黏)241092(偏軟)2(太黏)4412

表14 基質(zhì)配比正交實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果

Tab.14Resultsofvarianceanalysisonorthogonalexperimentofmatrixratio

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值石蠟(A)22.222.0011.1125.00<0.05單甘酯(B)0.892.000.441.00凡士林(C)24.892.0012.4428.00<0.05甘油(D)3.562.001.781.00>0.05

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

由表12，14結(jié)果可知，石蠟與凡士林用量是影響基質(zhì)成型的關(guān)鍵因素，直觀分析極差R顯示影響因素大小順序?yàn)镃>A>D>B，優(yōu)選配比為A1B2C2D1，即將石蠟2 g，單甘酯4 g，凡士林2 g分別加熱熔化后，與甘油1 g混合均勻制成乳化型膏貼基質(zhì)。

2.10乳化型膏貼劑型的體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn) 筆者在本研究前期將白芥子涂方藥材提取物制備為高含水量的巴布凝膠劑型[4]，并利用改良Franze透皮擴(kuò)散裝置，進(jìn)行了兩種基質(zhì)類型膏貼劑的離體大鼠皮膚透皮比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。從研究結(jié)果可以看出，對(duì)于細(xì)辛酯素和延胡索乙素兩項(xiàng)透皮指標(biāo)，乳化型膏貼的累積滲透量均明顯高于巴布凝膠劑型，這可能是由于前者具有較高的載藥量以及較好的皮膚角質(zhì)層親和能力與水化作用。

3 討論

白芥子涂方穴位敷貼以原粉入藥，不僅有效成分含量低，而且不利于質(zhì)量控制，筆者在本研究采用超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行選擇性高效提取[4]，并采用HPLC法對(duì)其含量進(jìn)行控制，制備出具有乳化性質(zhì)的硬膏劑型。該劑型與其他外用膏貼劑相比在載藥量、熔化性、均勻性、乳化性能、透皮性能方面具有顯著特點(diǎn)，同時(shí)體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了超臨界CO2萃取技術(shù)應(yīng)用于經(jīng)皮給藥制劑脂溶性有效成分提取的可行性與合理性，為進(jìn)一步研究指標(biāo)成分透皮行為奠定基礎(chǔ)。

有研究證實(shí)，白芥子中芥子酶活性[6]，以及甘遂中大戟二萜醇濃度[7-8]是引起皮膚刺激性的關(guān)鍵影響因素，有效控制系統(tǒng)中這兩種成分濃度水平以及釋放速率，可有效避免目前白芥子涂方皮膚刺激性大和質(zhì)量不可控的弊端。