石寶序，邵安勝

(山東省日照市嵐山區(qū)人民醫(yī)院1.神經(jīng)內(nèi)科；2.急診內(nèi)科，日照 276800)

神經(jīng)元可塑性是指在神經(jīng)元再生、損傷或死亡過(guò)程中，神經(jīng)元到神經(jīng)環(huán)路所發(fā)生的適應(yīng)性變化，這種變化可發(fā)生在大腦發(fā)育和成熟階段，并存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有高度可塑性，并且受到內(nèi)在因素和外界因素的影響[2]。神經(jīng)元可塑性的變化主要表現(xiàn)為大腦學(xué)習(xí)記憶功能、神經(jīng)元突觸、神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化等[3]。在發(fā)育中大腦中，大腦神經(jīng)元可塑性具有重要作用[4]。突觸素是神經(jīng)可塑性的分子標(biāo)志之一，可作為神經(jīng)元可塑性受損傷程度的指標(biāo)[5]。當(dāng)大鼠神經(jīng)元可塑性受到損傷后，大鼠腦內(nèi)突觸體內(nèi)突觸素免疫活性下降[5]。大量研究證明，吸入性麻醉氣體對(duì)人體具有神經(jīng)毒性[6]。七氟烷和地氟烷是兩種吸入性麻醉氣體，臨床常用于嬰幼兒麻醉[7]。嬰幼兒時(shí)期是大腦發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化十分敏感[8]。然而，目前對(duì)于七氟烷和地氟烷毒性作用的研究主要集中在老年大鼠，對(duì)于發(fā)育中大鼠的研究筆者較少見到。近期研究發(fā)現(xiàn)，急性暴露于吸入性麻醉劑會(huì)導(dǎo)致發(fā)育中大腦的病理性損傷，嚴(yán)重者可導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙[9]。筆者在本研究中對(duì)1個(gè)月齡SD大鼠分別給予3%七氟烷和地氟烷麻醉，其濃度接近于臨床嬰幼兒七氟烷和地氟烷麻醉劑量，以探討七氟烷和地氟烷對(duì)發(fā)育中大腦神經(jīng)元可塑性的影響，并研究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1個(gè)月齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量100～105 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0022。飼養(yǎng)室溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度45%～50%，每天光照時(shí)間12 h，自由進(jìn)食、進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2主要試劑 七氟烷(Sev，山東魯南貝特制藥有限公司，批號(hào)：65120501，設(shè)定出氣口七氟烷濃度3.2%)和地氟烷(Des，百特公司，批號(hào)：3957，設(shè)定出氣口地氟烷濃度7.5%)；內(nèi)源性大麻素2-AG注射液購(gòu)自江蘇瑞恒醫(yī)藥股份有限公司(批號(hào)：20112548，分析純)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemilumin escence,ECL)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(批號(hào)：20140303)；具脫氧尿苷單克隆(BrdU)抗體、人生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(grouth-associated protein-43,GAP-43)抗體、磷酯化神經(jīng)突觸素(phosphorvlated neuro syna ptophysin,SYN)抗體、微管相關(guān)蛋白2(microtubule associated protein,MAP-2)抗體和β-actin抗體均購(gòu)自Abcom公司；其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3大鼠的分組及給藥 選取1個(gè)月齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組、七氟烷組和地氟烷組，每組20只。大鼠禁食禁水12 h。以100%氧氣作為載氣，流量設(shè)置為2 L·min-1，麻醉箱內(nèi)溫度設(shè)定為37～38 ℃。當(dāng)麻醉箱內(nèi)七氟烷和地氟烷分別達(dá)到5%時(shí)，將大鼠放入麻醉箱內(nèi)，開始計(jì)時(shí)并保持吸入4 h。各箱氣體濃度采用麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)。

1.4行為學(xué)觀察 采用電刺激逃避即跳臺(tái)法觀察大鼠行為學(xué)特征。大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的觀察指標(biāo)為實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各大鼠出現(xiàn)的錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)和潛伏期。

實(shí)驗(yàn)裝置：跳臺(tái)裝置為 120 cm×80 cm×24 cm 有機(jī)玻璃箱，刺激電極為箱底銅柵。將箱子平均分為5格，大鼠回避電擊的安全臺(tái)為每格內(nèi)分別放置高 8.5 cm，直徑 10.5 cm 橡膠墊。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：將大鼠放入試驗(yàn)箱內(nèi)適應(yīng)5 min，以36 V交流電電擊大鼠。大鼠在遭電擊后逃上橡膠墊，再?gòu)南鹉z墊上跳下，以雙足接觸銅柵遭到電擊為錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)1次。先對(duì)大鼠進(jìn)行3 min訓(xùn)練，并記錄錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)。24 h后再進(jìn)行測(cè)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法同上，以大鼠首次從橡膠墊跳下時(shí)開始計(jì)時(shí)，作為大鼠觸電潛伏期，并以大鼠第1次和第2次測(cè)試過(guò)程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤次數(shù)作為學(xué)習(xí)記憶功能的觀察指標(biāo)。

1.5BrdU標(biāo)記反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)中大鼠腹腔注射BrdU溶液，50 mg·kg-1，共6 d，第7 天處死。迅速取出大鼠海馬組織，每組隨機(jī)選取6只大鼠對(duì)海馬組織進(jìn)行染色。經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosplate buffer saline,PBS)洗滌，4%多聚甲醛固定，山羊血清封閉，BrdU一抗工作液室溫孵育3 h。孵育結(jié)束后，采用二抗工作液室溫孵育15 min。顯色后，經(jīng)蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。熒光顯微鏡下觀察并分析。Image Pro Plus 6.0對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的積分吸光度值(A值)，其中陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的強(qiáng)度和數(shù)量與A值成正比。

1.6大鼠海馬組織相關(guān)蛋白的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，迅速分離海馬組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛∧X組織蛋白，采用Western bloting檢測(cè)海馬組織GAP-43、SYN和MAP-2蛋白表達(dá)水平。

將大鼠海馬組織置于研缽，加入一定體積蛋白裂解液，充分研磨，于冰上裂解30 min，4 ℃下12 000×g離心10 min，吸取上清液，并使用BCA蛋白濃度試劑盒對(duì)其進(jìn)行蛋白定量。選取5%濃縮膠和10%分離膠，取20 μL蛋白樣品進(jìn)行上樣，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。10%脫脂乳粉溶液封閉2 h，一抗(1：1000)4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次15 min，二抗(1：4000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次。化學(xué)發(fā)光法對(duì)蛋白顯色。

2 結(jié)果

2.1對(duì)發(fā)育中大鼠逃避行為潛伏期的影響 正常對(duì)照組、七氟烷組、地氟烷組潛伏期分別為(53.32±6.34)，(35.34±3.37)，(36.94±4.14) s。行為學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，與正常對(duì)照組比較，七氟烷組和地氟烷組第一次跳下平臺(tái)潛伏期均顯著縮短(P<0.01)，提示七氟烷和地氟烷對(duì)發(fā)育中大鼠的逃避行為潛伏期有消極影響。

2.2對(duì)發(fā)育中大鼠學(xué)習(xí)記憶錯(cuò)誤次數(shù)的影響 正常對(duì)照組、七氟烷組、地氟烷組平均錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)分別為(1.94±1.04)，(4.47±1.59)，(3.93±1.43)。與正常對(duì)照組比較，七氟烷組和地氟烷組錯(cuò)誤次數(shù)均顯著增加(P<0.01)，提示七氟烷和地氟烷均可以在一定程度上損傷大鼠發(fā)育中大腦的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.3對(duì)發(fā)育中大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響 正常對(duì)照組、七氟烷組、地氟烷組BrdU分別為(3.45±0.54)×105，(2.17±0.39)×105，(2.03±0.28)×105。BrdU標(biāo)記反應(yīng)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照比較，七氟烷組和地氟烷組大鼠腦內(nèi)損傷區(qū)周圍BrdU標(biāo)記反應(yīng)顯著減弱(P<0.01)，提示七氟烷和地氟烷與抑制發(fā)育中大腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化有關(guān)。

2.4對(duì)發(fā)育中大鼠海馬組織GAP-43蛋白表達(dá)的影響 見圖1。正常對(duì)照組、七氟烷組、地氟烷組GAP-43蛋白表達(dá)分別為(0.95±0.14)，(0.27±0.09)，(0.14±0.02)。Western Blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，七氟烷組和地氟烷組大鼠發(fā)育中腦內(nèi)海馬組織中GAP-43蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明七氟烷和地氟烷均能夠下調(diào)大腦發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元突起生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)，從而抑制發(fā)育大腦神經(jīng)元的可塑性。

2.5對(duì)發(fā)育中大鼠海馬組織中SYN蛋白表達(dá)的影響 見圖1。正常對(duì)照組、七氟烷組、地氟烷組SYN蛋白表達(dá)量分別為(0.91±0.14)，(0.37±0.09)，(0.23±0.08)。Western bloting結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，七氟烷組和地氟烷組大鼠發(fā)育中腦內(nèi)海馬組織中SYN蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明七氟烷和地氟烷均能夠下調(diào)大腦發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元突起生長(zhǎng)相關(guān)蛋白SYN的表達(dá)，從而抑制發(fā)育大腦神經(jīng)元的可塑性。

圖1 3組大鼠海馬組織GAP-43蛋白表達(dá)情況

圖2 3組大鼠海馬組織SYN蛋白表達(dá)情況

2.6對(duì)發(fā)育中大鼠海馬組織中MAP-2蛋白表達(dá)的影響 見圖2。正常對(duì)照組、七氟烷組、地氟烷組MAP-2的蛋白表達(dá)量分別為(0.86±0.11)，(0.34±0.08)，(0.27±0.06)。Western bloting結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，七氟烷組和地氟烷組大鼠發(fā)育中腦內(nèi)海馬組織中MAP-2蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)，提示七氟烷和地氟烷均能下調(diào)大腦發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元突起生長(zhǎng)相關(guān)蛋白MAP-2的表達(dá)，從而抑制發(fā)育大腦神經(jīng)元的可塑性。

圖3 3組大鼠海馬組織MAP-2蛋白表達(dá)情況

3 討論

嬰幼兒時(shí)期是大腦的發(fā)育時(shí)期，此時(shí)神經(jīng)可塑性強(qiáng)，也是各種腦損傷治療的最佳時(shí)期，但也極易受到內(nèi)外因素影響[10]。嬰幼兒手術(shù)中，吸入性麻醉藥廣泛應(yīng)用于臨床[11]。吸入性麻醉藥主要作用為降低腦血管阻力、擴(kuò)張血管、增加腦血流等，其中七氟烷和地氟烷均具有較強(qiáng)的血管擴(kuò)張作用[12]。七氟烷作為常見吸入性麻醉藥，可快速使患者失去知覺，并在術(shù)后可快速恢復(fù)，因此廣泛應(yīng)用于臨床手術(shù)[13]。地氟烷主要作用是使交感神經(jīng)興奮、心率增快、血壓升高，從而使腦部血流加速[14]。當(dāng)使用地氟烷麻醉時(shí)，如在短時(shí)間內(nèi)提高地氟烷吸入劑量，可對(duì)大腦和心血管產(chǎn)生損傷。嬰幼兒時(shí)期是大腦發(fā)育高峰期，因此對(duì)吸入性麻醉藥較敏感[15]。吸入性麻醉藥具有一定程度神經(jīng)毒性，尤其是對(duì)發(fā)育中大腦學(xué)習(xí)記憶功能的損傷較顯著。本研究結(jié)果顯示，七氟烷和地氟烷均可以顯著增加大鼠錯(cuò)誤次數(shù)，并顯著縮短第一次跳下平臺(tái)潛伏期，說(shuō)明七氟烷和地氟烷均可在一定程度上損傷大鼠發(fā)育中大腦的學(xué)習(xí)記憶能力。

在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和向多種神經(jīng)細(xì)胞分化的潛力。腦部受損后，神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生增殖、分化及遷移現(xiàn)象，從而修復(fù)受損區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞[16]。BrdU作為一種DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，可通過(guò)標(biāo)記細(xì)胞反映神經(jīng)干細(xì)胞的增殖強(qiáng)度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，七氟烷組和地氟烷組大鼠腦內(nèi)損傷區(qū)周圍BrdU的標(biāo)記反應(yīng)顯著減弱，推測(cè)七氟烷和地氟烷與抑制發(fā)育中大腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化有關(guān)，從而阻礙大腦受損部位的神經(jīng)修復(fù)過(guò)程。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)元可塑性是大腦學(xué)習(xí)記憶功能的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，多種蛋白參與調(diào)控神經(jīng)元的可塑性，如突觸形成的SYN、GAP-43和MAP-2[17]。研究發(fā)現(xiàn)，大腦海馬組織是與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的區(qū)域，是神經(jīng)元可塑性常發(fā)生的部位。GAP-43作為神經(jīng)組織中與生長(zhǎng)相關(guān)的專一性蛋白，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及再生，是神經(jīng)重塑的分子標(biāo)志之一。在神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育下，GAP-43蛋白表達(dá)量較高，而當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受損后，GAP-43蛋白表達(dá)量顯著降低[18]。SYN是突觸中的特異性標(biāo)志膜蛋白，可調(diào)節(jié)突觸可塑性，并作為評(píng)價(jià)神經(jīng)元重塑性的標(biāo)志物[19]。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，SYN表達(dá)量可間接反映突觸大小和數(shù)量變化。MAP-2是微管相關(guān)蛋白家族成員之一，是神經(jīng)細(xì)胞的骨架成分，與突觸可塑性及神經(jīng)元的生長(zhǎng)再生具有密切的關(guān)系，可作為神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的分子標(biāo)志物之一[20]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦神經(jīng)受損后，大腦組織MAP-2表達(dá)顯著減少。本研究表明，七氟烷和地氟烷均能夠下調(diào)大腦發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)重塑相關(guān)蛋白GAP-43、SYN和MAP-2的蛋白表達(dá)，從而抑制發(fā)育大腦神經(jīng)元的可塑性。

綜上所述，七氟烷和地氟烷均對(duì)發(fā)育中大腦的學(xué)習(xí)記憶能力具有一定的損傷作用，并可通過(guò)抑制內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化，下調(diào)大腦發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元突起生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43、SYN和MAP-2的表達(dá)，從而抑制發(fā)育大腦神經(jīng)元的可塑性。