紅梅，李先加，劉有菊，普措多杰

(1.藏藥新藥開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省藏藥新藥開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省藏醫(yī)藥研究院，西寧 810016；2.青海大學(xué)藏醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

痛風(fēng)是由于嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄障礙引起血尿酸增高的代謝性疾病，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis，AGA)是其最常見首發(fā)癥狀。主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)紅腫熱痛，嚴(yán)重可導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。AGA是痛風(fēng)的典型表現(xiàn)形式[1]，受累關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和前列素E2(prostaglandin E2, PGE2)等炎癥因子增加，產(chǎn)生關(guān)節(jié)軟骨的炎癥損傷，誘導(dǎo)基質(zhì)降解，導(dǎo)致疼痛、腫脹等，從而破壞關(guān)節(jié)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙[2-3]。研究表明，體內(nèi)尿酸鈉鹽晶體作用于血小板、中性粒細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、單核細(xì)胞，刺激這些細(xì)胞釋放多種炎癥遞質(zhì)，如Ca2+、PGE2等， 這些炎性細(xì)胞因子通過自分泌和旁分泌在痛風(fēng)發(fā)病的過程中發(fā)揮重要作用[4]。很多經(jīng)典藏藥制劑對(duì)痛風(fēng)有獨(dú)特療效，筆者在藏醫(yī)理論的指導(dǎo)下，通過查閱藏醫(yī)藥文獻(xiàn)，從眾多藏醫(yī)藥古方中篩選出藏藥十五味云鵬散(sPos Khyung bCo lNga)[5]，其方源《藏醫(yī)治療寶庫》有近800年的臨床用藥歷史，其方源《貢珠藏醫(yī)紀(jì)要及其注釋》中十五味云鵬散有2種方劑，一種無汞炮制品制劑由乳香、決明子、黃葵子、巴夏嘎、訶子、毛訶子、木香、余甘子、寬筋藤、渣馴膏、藏菖蒲、兒茶、安息香、生烏頭、麝香等藥材組成，另一種是含汞炮制品制劑，由乳香、決明子、黃葵子、巴夏嘎、毛訶子、余甘子、寬筋藤、渣馴膏、藏菖蒲、兒茶、安息香、生烏頭、麝香、水銀熱制炮制品、西藏貓乳等藥材組成[6]。藏文名布瓊覺安。十五味云鵬丸是藏醫(yī)治療關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)腔積水、皮疹、皮膚瘙癢諸證的古方，至今已有一千多年的歷史?，F(xiàn)有的資料只是該藥治療疾病的臨床研究總結(jié)，實(shí)驗(yàn)研究尚少。筆者在本實(shí)驗(yàn)觀察十五味云鵬散含汞或無汞制劑對(duì)AGA及相關(guān)炎癥因子的影響變化，以期為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1藥品及試劑 本實(shí)驗(yàn)中所用十五味云鵬散有含汞制劑和無汞制劑兩種制劑。十五味云鵬散含汞制劑含水銀炮制品40 mg·g-1生藥，無汞制劑未添加水銀炮制品，產(chǎn)品批號(hào)均為20150305，由青海大學(xué)藏醫(yī)學(xué)院提供；秋水仙堿片，云南昊邦制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：141120，規(guī)格：0.5 mg；尿酸鈉，美國SIGMA-ALDRICH公司產(chǎn)品，批號(hào)：BCBF1330V；TNF-α、IL-1β、PGE2德國國際品牌聯(lián)盟(INTERNATIONAL BRAND LEAGUE，IBL)試劑盒，購于上海郁溪生物科技有限公司。

1.2儀器 JD1060-2電子天平，感量：0.1 g，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；TDL-5離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SpectraMaxI3多功能酶標(biāo)儀，美國MD公司。

1.3動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)SD雄性大鼠70只，體質(zhì)量130～150 g，5周齡，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)條件：溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度：45%～50%，自然光照，排氣扇通風(fēng)。

1.4尿酸鈉溶液的制備 稱取尿酸鈉2500 mg，充分研磨，加0.9%氯化鈉溶液100 mL，同時(shí)加溫?cái)嚢璩?5 mg·mL-1尿酸鈉混懸液[7]。

1.5分組與給藥 將健康SPF級(jí)SD雄性大鼠70只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，稱體質(zhì)量，簡單隨機(jī)法分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，秋水仙堿片組，十五味云鵬散含汞制劑大、小劑量組及無汞制劑大、小劑量組，每組10只。根據(jù)人與動(dòng)物給藥劑量換算方法，十五味云鵬散含汞制劑和無汞制劑大、小劑量組給藥劑量分別為0.28，0.07 g·kg-1、秋水仙堿片組給藥劑量0.6 mg·kg-1。將藥物溶于純凈水，配制成相應(yīng)濃度藥液?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組給予相應(yīng)體積純凈水，造模同天開始灌胃給藥，連續(xù)5 d。

1.6AGA大鼠模型的制備[8]大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，50 mg·kg-1。用記號(hào)筆在大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)周圍標(biāo)記，局部乙醇消毒，大鼠右踝關(guān)節(jié)擺放成直角，充分暴露踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間間隙，以45°夾角穿向大鼠右后肢背側(cè)正中踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間關(guān)節(jié)腔，將25 mg·mL-1尿酸鈉溶液0.2 mL注入踝關(guān)節(jié)腔，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn)，即成大鼠AGA模型。 空白對(duì)照組以0.9%氯化鈉溶液代替尿酸鈉溶液。

1.7關(guān)節(jié)腫脹度的測量 造模前，造模后24，48，72 h分別在大鼠右后足踝關(guān)節(jié)上方1.0 cm 處用編號(hào)筆作一橫線標(biāo)記，無彈性軟皮尺測量大鼠受試踝關(guān)節(jié)相同部位周徑，測注射后不同時(shí)間踝關(guān)節(jié)周徑，每次重復(fù)測量3次，取平均值。關(guān)節(jié)腫脹度=造模后關(guān)節(jié)周徑-造模前關(guān)節(jié)周徑[9]。

1.8血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量測定 造模第5天，末次給藥后1 h處死大鼠，取腹主動(dòng)脈血2 mL，3000 r·min-1離心10 min(r=10 cm)，分離血清，保存，備用。按ELISA試劑盒操作說明書，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、PGE2含量[9]。

2 結(jié)果

2.1大鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹程度 造模后24～72 h，模型對(duì)照組踝關(guān)節(jié)腫脹度較空白對(duì)照組明顯增加(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，造模后24～48 h，十五味云鵬散含汞制劑(大劑量組48 h除外)和無汞制劑各劑量組受試足踝關(guān)節(jié)腫脹度均明顯降低(P<0.05)；造模72 h后明顯降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量明顯升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，十五味云鵬散含汞制劑大、小劑量組大鼠血清IL-1β、PGE2顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，無汞制劑大劑量組血清PGE2顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 7組大鼠不同時(shí)間踝關(guān)節(jié)腫脹度測定結(jié)果

組別劑量/(g·kg-1)24 h48 h72 h空白對(duì)照組—-0.18±0.16-0.16±0.13-0.16±0.13模型對(duì)照組—0.88±0.35?10.66±0.38?10.42±0.42?1秋水仙堿片組0.00060.52±0.24?20.28±0.24?20.22±0.23十五味云鵬散含汞制劑 小劑量組0.070.56±0.16?20.31±0.17?20.18±0.36 大劑量組0.280.55±0.21?20.38±0.210.21±0.15十五味云鵬散無汞制劑 小劑量組0.070.57±0.19?20.33±0.14?20.19±0.14 大劑量組0.280.54±0.14?20.28±0.17?20.15±0.18

與空白對(duì)照組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05

表2 7組大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量測定結(jié)果

Tab.2DeterminationresultsoftheserumlevelsofTNF-α,IL-1βandPGE2insevengroupsofrats

組別劑量/(g·kg-1)IL-1βTNF-αPGE2空白對(duì)照組—6.38±1.3778.68±16.71104.78±17.63模型對(duì)照組—8.10±1.78?198.19±20.78?1138.62±40.77?1秋水仙堿片組0.00066.70±0.38?282.69±10.12?298.09±23.89?2十五味云鵬散含汞制劑 小劑量組0.076.72±0.90?283.77±21.7196.71±24.07?2 大劑量組0.286.64±0.37?281.56±14.2292.08±15.99?3十五味云鵬散無汞制劑 小劑量組0.078.20±2.2286.35±20.91120.81±48.97 大劑量組0.286.73±1.3685.59±10.9196.58±33.71?2

與空白對(duì)照組比較，*1P<0.05；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with blank control group，*1P<0.05，;compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

3 討論

研究表明，炎癥細(xì)胞招募與內(nèi)皮細(xì)胞激活所引發(fā)的炎癥因子IL-1β和 TNF-α 等釋放和炎癥反應(yīng)，在AGA 疾病過程中起重要作用[10-11]，AGA發(fā)作的特征性表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑液內(nèi)中性粒細(xì)胞募集反應(yīng)[12]。尿酸鈉晶體被單核吞噬細(xì)胞攝取后可誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子及炎癥趨化因子生成，導(dǎo)致單核吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞聚集于炎癥部位，觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]。臨床一般采用秋水仙堿、非甾體抗炎藥或糖皮質(zhì)激素治療AGA， 但這些藥物均無法避免變態(tài)反應(yīng)、中毒、骨髓抑制、肝腎損害等不良反應(yīng)。十五味云鵬散具有消炎止痛作用，用于關(guān)節(jié)紅腫疼痛、發(fā)癢等癥，臨床治療效果明確[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，十五味云鵬散含汞制劑和無汞制劑均能顯著降A(chǔ)GA模型大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度，該藥理作用可能與本方中安息香、生烏頭、兒茶、藏菖蒲、麝香的消炎、止痛、斂黃水作用有關(guān)[16]；曾煦欣等[17]研究發(fā)現(xiàn)，余甘子甲醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位為余甘子抗炎鎮(zhèn)痛的有效部位，其中以甲醇與正丁醇部位作用最強(qiáng)，推斷余甘子治療AGA的主要機(jī)制是抑制炎性遞質(zhì)PGE2和TNF-α釋放。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小、大劑量含汞制劑明顯能降低AGA大鼠血清IL-1β、PGE2水平，并存在量效關(guān)系；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，無汞制劑只有大劑量組PGE2水平顯著降低。與模型對(duì)照組比較，對(duì)IL-1β、TNF-α細(xì)胞因子的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示十五味云鵬散含汞制劑較無汞制劑能更明顯抑制AGA模型大鼠血清IL-1β、PGE2水平，這可能因?yàn)楹苿┲信溆昧颂厥馀谥频拿F藥材汞炮制品，并且汞炮制品具有祛風(fēng)、化毒、療瘡等顯著效果[18]，起到了增強(qiáng)藥效、快速降低或抑制炎癥因子分泌作用，可緩解癥狀，從而有效治療AGA。