楊 帆，黃 旭，吳夢(mèng)麗，高 慧，謝陽姣，2

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200）

防己為防己科千金藤屬（Stephaniatetradra S.Moore）多年生落葉藤本植物，以根入藥，具有祛風(fēng)濕、利水消腫的功效［1］，其主要化學(xué)成分為生物堿類，包括粉防己堿、防己諾林堿、氧化防己堿等［2］。防己作為漢防己甲素片、防己關(guān)節(jié)丸等中成藥的原料藥在臨床上廣泛應(yīng)用［3-5］。薄層色譜法是中藥化學(xué)成分鑒定中常規(guī)方法之一，具有能同時(shí)分離多種樣品、固定相和流動(dòng)相的選擇與變換靈活性大等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥物分析、中藥檢驗(yàn)、藥物分離純化、中藥指紋圖譜等多個(gè)領(lǐng)域［6-10］。在《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部有關(guān)防己的標(biāo)準(zhǔn)中［1］，采用薄層方法對(duì)其進(jìn)行定性分析，其中使用的展開劑含有易制毒化學(xué)物三氯甲烷（氯仿）。張紹軒等［11］采用薄層色譜法對(duì)利心丸中牡丹皮、防己進(jìn)行定性研究，以及黃蘅［12］采用薄層色譜研究炎見寧片中防己的化學(xué)成分，兩者所用展開劑中同樣含有三氯甲烷。三氯甲烷對(duì)檢測(cè)人員具有較大的危害，宜進(jìn)行優(yōu)化。本研究擬在藥典標(biāo)準(zhǔn)上，對(duì)防己的薄層色譜法進(jìn)行優(yōu)化，去除三氯甲烷等有毒物質(zhì)，優(yōu)化顯色程序，為防己的快速鑒別提供更優(yōu)的方法。此外，采用優(yōu)化的薄層色譜法對(duì)防己根、莖、葉等不同部位進(jìn)行化學(xué)成分分析，初步探索防己不同部位的化學(xué)成分，為挖掘防己藥材更多的藥用價(jià)值提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材 防己藥材于2018年10月采集于南寧和武鳴防己藥材種植基地，經(jīng)謝陽姣研究員鑒定為正品。藥材經(jīng)60℃烘干后粉碎，過三號(hào)篩，置-4℃冰箱保存?zhèn)溆?。其中，條件考察均采用同一樣品，均為種植于武鳴的福建金坑鄉(xiāng)下炕組藥材的根。不同部位試驗(yàn)藥材為廣西南寧種植基地安徽3號(hào)根、莖、葉。

1.2 儀器與試藥 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；千分之一電子天平（上海蒲春計(jì)量?jī)x器有限公司）；Sartorius BP211D分析天平（十萬分之一）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；粉碎機(jī)（永康市速峰工貿(mào)有限公司）；雙槽展開缸（上海信宜儀器廠）；硅膠GF254板（青島海洋化工有限公司制造，規(guī)格25 mm×75 mm，批號(hào)20180626，厚度0.20～0.25 mm）；硅膠G板（青島海洋化工有限公司制造，規(guī)格50 mm×100 mm，批號(hào)20170626，厚度0.20～0.25 mm）；硅膠G板（青島海洋化工有限公司制造，規(guī)格100 mm×100 mm，批號(hào)20170626，厚度0.20～0.25 mm）；其余所用試劑均為分析純；粉防己堿對(duì)照品購自中國(guó)食品藥品鑒定研究院（批號(hào)110711-201609，含量99.2%）；防己諾林堿對(duì)照品購自北京中興嘉仁生物技術(shù)有限公司（批號(hào)170301-005，含量98%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取粉防己堿對(duì)照品、防己諾林堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 ml含粉防己堿0.1 mg、防己諾林堿0.05 mg的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取本品根、莖、葉粉末（過三號(hào)篩）各約0.5 g，精密稱定，分別精密加入2%鹽酸甲醇溶液25 ml，稱定重量，超聲15 min，放冷，再稱定重量，用2%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 ml，置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得。

2.3 TLC鑒別結(jié)果

2.3.1 藥典法 參照薄層色譜法［1］試驗(yàn)，分別吸取供試品、對(duì)照品溶液各5 μl，點(diǎn)樣于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-5%濃氨液（6∶1∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，結(jié)果見圖1。

2.3.2 改進(jìn)的方法 取防己根、莖、葉粉末各1 g，分別加2%鹽酸甲醇15 ml，常溫超聲提取30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?%鹽酸甲醇5 ml使溶解，作為供試品溶液。另取粉防己堿對(duì)照品、防己諾林堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各8 μl，分別于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，結(jié)果見圖2。

圖1 防己根、莖、葉TLC圖譜（藥典方法）

圖2 防己根、莖、葉TLC圖譜（改進(jìn)?的方法）

圖1 、圖2結(jié)果顯示，采用以上2種方法，在與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的色譜位置上供試品均顯相同顏色的斑點(diǎn)，且分離度均較好。比較根、莖、葉的色譜斑點(diǎn)數(shù)可知，所有部位藥典法顯色斑點(diǎn)數(shù)均少于改進(jìn)的方法，為更有效地鑒別化學(xué)成分差異，宜選擇改良的方法進(jìn)行鑒別。由改良方法的顯色結(jié)果可知，各斑點(diǎn)顯色程度有差異，根中的斑點(diǎn)顯色較清晰。斑點(diǎn)顏色的深淺通?？纱砗康母叩?，可見，防己藥材無論是在不同部位還是主要成分的含量上均有著明顯的差異。

3 討 論

據(jù)報(bào)道，不同的提取溶劑、提取方法、點(diǎn)樣量、展開劑等對(duì)薄層色譜結(jié)果都會(huì)產(chǎn)生影響。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述影響因素進(jìn)行了考察。

3.1 不同提取溶劑比較 試驗(yàn)考察了50%甲醇、100%甲醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、1%三乙胺甲醇、2%鹽酸甲醇等提取溶劑，發(fā)現(xiàn)每種提取溶劑差異不顯著，綜合考慮斑點(diǎn)大小和顏色深淺，選擇2%鹽酸甲醇作為最終的提取溶劑。

3.2 不同提取方法考察 以2%鹽酸甲醇為提取溶劑，考察藥典法回流1 h、超聲1 h、超聲30 min、超聲15 min的差異，發(fā)現(xiàn)4種提取方法顯色均較清晰，沒有顯著差異；但回流微有拖尾，且回流加熱操作復(fù)雜，擬考慮超聲提取。3個(gè)超聲時(shí)間之間，從節(jié)省時(shí)間方面考慮，選擇超聲15 min作為本試驗(yàn)的提取方法。

3.3 點(diǎn)樣量考察 試驗(yàn)分別對(duì) 8 μl、10 μl、12 μl、14 μl、16 μl點(diǎn)樣量進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，8 μl和10 μl之間顯色和斑點(diǎn)大小均無差異，12 μl、14 μl、16 μl存在不同程度的拖尾，故以8 μl和10 μl點(diǎn)樣量較好，從節(jié)省點(diǎn)樣量考慮，本試驗(yàn)采用8 μl為點(diǎn)樣量。

3.4 不同展開體系的考察 綜合文獻(xiàn)研究，本實(shí)驗(yàn)考察了乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（6∶1∶1∶0.1）、正丁醇∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（6∶1∶1∶0.1）、異丙醇∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（6∶1∶1∶0.1）、氯仿∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（6∶1∶1∶0.1）及乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3），發(fā)現(xiàn)除了乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3）能達(dá)到有效分離外，其他方法均有不同程度的拖尾，因此本試驗(yàn)采用乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3）為展開劑。

3.5 藥典和改進(jìn)的展開劑比較分析 試驗(yàn)考察了藥典法展開劑氯仿∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（6∶1∶1∶0.1）與改良的展開劑乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%濃氨液（7∶1∶0.7∶0.3）的展開效果。如果僅考察防己的主要藥用成分粉防己堿和防己諾林堿，藥典法和改良法的分離度和顯色程度均較好。但對(duì)于其他可能含量較低的化學(xué)成分，藥典法顯色效果較改良的方法差，顯色斑點(diǎn)數(shù)較少。在展開劑組分方面，藥典法展開劑中含有毒性較大的易制毒化學(xué)品氯仿，本試驗(yàn)試圖把氯仿?lián)Q為極性相似的異丙醇、正丁醇、乙酸乙酯，其他溶劑不變，發(fā)現(xiàn)異丙醇、正丁醇在跑板中很慢，分離度不好且拖尾嚴(yán)重，乙酸乙酯分離度也較差，但跑板快且顯示的斑點(diǎn)比藥典法多1個(gè)。通過調(diào)整乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%氨水的比例，發(fā)現(xiàn)在乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3）的條件下，各成分斑點(diǎn)分離清晰，效果最好。藥典方法使用的展開劑中含易制毒化學(xué)物質(zhì)氯仿，潛在危害較大，改進(jìn)的方法以低毒的乙酸乙酯代替氯仿，克服了這一不足；其次能展現(xiàn)更多的化學(xué)成分，對(duì)于鑒定防己不同部位化學(xué)成分差異具有更好的效果。

本試驗(yàn)采用改良的展開劑，能分離更多的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)根中有2個(gè)斑點(diǎn)莖中沒有出現(xiàn)，同時(shí)莖中有2個(gè)斑點(diǎn)根中沒有發(fā)現(xiàn)，表明通過充分的分離，根與莖化學(xué)成分存在差異。葉與根的化學(xué)成分差異較大，但與莖有多個(gè)相同的斑點(diǎn)，表明地上部分化學(xué)成分具有相似之處。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，莖含有與根相同的主要活性成分粉防己堿和防己諾林堿，由于防己為落葉多年生植物，塊根生長(zhǎng)緩慢資源日漸不足，對(duì)根的藥用功效進(jìn)行開發(fā)，適當(dāng)替代防己根的應(yīng)用，可緩解防己資源的壓力。同時(shí)加大對(duì)葉的藥用功效的開發(fā)，可擴(kuò)大防己的生物利用度，減少資源浪費(fèi)。

本試驗(yàn)建立的2%鹽酸甲醇、超聲提取15 min為提取條件，硅膠G為薄層板、乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3）為展開劑、稀碘化鉍鉀為顯色劑、點(diǎn)樣量8 μl，常溫展開的薄層色譜條件，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，能有效鑒別防己藥材不同部位的化學(xué)成分；防己根、莖、葉在化學(xué)成分類別和含量上均存在差異，可對(duì)其功效差異進(jìn)一步研究，為防己藥材高效利用提供參考。