魏洪敏 甄長偉 煉曉璐 李銀賀 柴 剛

(北京海光儀器有限公司,北京100015)

前言

元素的毒性與元素的存在形態(tài)息息相關，就砷元素而言，無機砷的毒性要大于有機砷[1-2]。因此，在分析砷元素時，其形態(tài)分析是十分必要的，比用砷的總量來評價更具科學性。近年來聯(lián)用技術已經(jīng)成為元素形態(tài)分析的主要手段。高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法可以對砷元素各形態(tài)進行有效分離，然后再逐一檢測，從而實現(xiàn)樣品的在線分離與測定。目前該方法已用于土壤[3]、大米[4]、水產(chǎn)動植物[5]、地下水[6]等樣品中砷元素的形態(tài)分析。

食品安全國家標準GB 5009.11—2014《食品中總砷和無機砷的測定》，應用的是液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法[7]。本文圍繞該標準，使用液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀，對樣品前處理方法、流動相、氫化反應條件等進行了優(yōu)化。并在最優(yōu)條件下對稻米及稻米標準物質進行分析測定，也對方法的精密度、加標回收率、檢出限等指標進行了驗證，測定結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-AFS 6500液相-原子熒光聯(lián)用儀(北京海光儀器有限公司)、微波消解儀(上海新儀微波化學科技有限公司)、真空抽濾裝置(天津奧特賽斯儀器有限公司)、BGZ-76電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司)、高性能空心陰極燈(北京有色金屬研究總院)、pH計、離心機等。

磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸(優(yōu)級純，北京化工廠)、硝酸(優(yōu)級純)、硼氫化鉀，除另有說明，所用試劑均為分析純，且購買于國藥集團化學試劑有限公司。

砷形態(tài)溶液標準物質購買于中國計量科學研究院：亞砷酸根[GBW08667，(75.7±1.2) μg/g]，二甲基砷酸[GBW08666，(52.9±1.8) μg/g]，甲基砷酸[GBW08669，(25.1±0.8) μg/g]，砷酸根[GBW08667，(17.5±0.4) μg/g]，含量均以As計。

1.2 樣品前處理

稱取約1.0 g樣品于微波消解罐中，加20 mL硝酸溶液(0.15 mol/L)，用微波消解儀90 ℃下恒溫提取50 min。提取完畢后冷卻至室溫，于8 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，使用液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀進行測定。

1.3 分析條件

砷形態(tài)的測定條件如表1所示。

表1 砷形態(tài)測定條件

2 結果與討論

本文對影響測量的條件進行了優(yōu)化，包括樣品前處理、流動相選擇、氫化物發(fā)生條件。

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理

形態(tài)分析的前處理一定要保證被測組分不能發(fā)生形態(tài)轉變。選取了某糙米樣品(含As(III)和DMA兩種目標組分)，使用稀硝酸進行提取，研究了熱浸提取和微波提取兩種方法。

熱浸提?。悍Q取約1.0 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL硝酸溶液(0.15 mol/L)，放置過夜。于90 ℃恒溫箱中熱浸提2.5 h，每30 min振搖1 min。提取完畢，取出冷卻至室溫，于8 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，使用液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀進行測定。

微波提?。喊礃悠诽幚矸椒ㄌ幚順悠罚謩e提取了20、30、40、50、60 min，結果表明，50 min時，目標組分已基本提取完全。

兩種方法經(jīng)過對比分析發(fā)現(xiàn)，微波提取與熱浸提取的測定結果相當，鑒于微波提取大大縮短了樣品前處理的時間，最終選用了微波提取，且提取時間為50 min。

2.1.2 流動相

2.1.2.1 流動相的選擇

不同的元素形態(tài)具有不同的理化性質和毒性，不同形態(tài)的砷化合物能夠被離子交換色譜分離的主要原因是：在適宜的pH值下，砷的化合物能夠在流動相中電離，以不同離子形態(tài)存在于水溶液中。通常，對流動相有如下要求：1)對被分析物具有合適的溶解度，并提供離子交換所必須的緩沖溶液；2)對被測離子有不同的洗脫能力，能從分離柱中依次取代這些離子；3)要有合適的離子強度，以控制各目標分析物的保留時間。離子交換色譜一般都以各種鹽類的緩沖溶液作流動相，通過調節(jié)緩沖溶液類型、pH值、離子強度，以及通過加少量有機溶劑等增加對被分析物的分離選擇性，使待測樣品達到良好的分離效果[8]。

使用Hamilton陰離子交換柱，以15 mmol/L磷酸二氫銨(pH=6)為流動相，分離測定砷元素的4個形態(tài)(As(III)、MMA、DMA和As(V))，分析時間約為15 min。為提高效率縮短分析時間，對流動相進行了調整。參照文獻[9]，選取了KH2PO4-Na2HPO4緩沖體系，并摸索了其對砷形態(tài)分離的影響。最終確定的流動相組成為KH2PO4(45 mmol/L)-Na2HPO4(5 mmol/L)，使用該流動相砷形態(tài)4個組分能夠在7 min內達到基線分離，分析時間遠遠低于國家標準“GB5009.17—2014”中給出參考的12 min。

2.1.2.2 流動相的配制

NH4H2PO4(15 mmol/L，pH=6)：稱取1.7g NH4H2PO4，溶于1 000 mL水中，用氨水調節(jié)pH值為6.0。

KH2PO4(45 mmol/L)-Na2HPO4(5 mmol/L)：稱取3.026 g KH2PO4和0.895 4 g Na2HPO4·12H2O，溶于500 mL水中，混勻，溶液的pH值為5.91，無需調節(jié)。

2.1.2.3 流動相的優(yōu)化

按表2的比例配制流動相(pH值實測值與表中吻合)，分別使用上述流動相對砷形態(tài)標準溶液進行洗脫，LC-AFS的其余測定條件見表1。測定結果見圖1，從上至下對應流動相的pH值分別為：5.29、5.59、5.91、6.24、6.47、6.64、6.81、9.18，從圖中可知：1)隨著流動相pH值的增大，As(III)保留時間基本保持不變，As(V)的保留時間逐漸縮短；2)pH值為5.91時，各組分分離效果最好；3)pH值較低時，As(III)和DMA分離不好；4)pH值較高時，DMA和MMA分離不好，甚至兩色譜峰完全重疊。

表2 KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液

為獲得更好的分離效果，在KH2PO4和Na2HPO4比例為9∶1的條件下，對流動相進行稀釋以降低離子強度。實驗了總濃度為50 mmol/L和25 mmol/L的流動相，其pH值均為5.91，并與表格中的1/15 mol/L(總濃度為66.7 mmol/L)的流動相進行對比分析，各組分的分離效果見圖2。從圖2可知，隨著流動相中鹽濃度的降低，各組分的分離效果變好，但某些組分的保留時間延長且峰展寬嚴重。綜合考慮選擇了50 mmol/L[KH2PO4(45 mmol/L)-Na2HPO4(5 mmol/L)]的緩沖鹽作為流動相。

圖1 流動相對砷形態(tài)分離效果的影響Figure 1 Effect of mobile phase on the separation efficiency of arsenic speciation

圖2 離子強度對分離效果的影響Figure 2 Effect of ionic strength on the separation efficiency of arsenic speciation.

2.1.3 氫化反應條件

2.1.3.1 載流

以鹽酸為載流，研究了其濃度對各形態(tài)峰面積的影響。從圖3可知，當載流濃度為2%時，峰面積較小，可能是由于酸濃度低時，反應速率低導致響應值低；載流濃度為5%時，峰面積最大。載流濃度大于10%時，各組分的峰面積逐漸降低，可能是由于反應過程中產(chǎn)生的大量氫氣稀釋了原子化器中砷元素的濃度。但當載流為10%時譜圖的基線更平穩(wěn)。最終，選擇載流濃度為10%。

圖3 載流濃度對峰面積的影響Figure 3 Effect of concentration of carrier currenton the peak area.

2.1.3.2 還原劑

還原劑的作用是在一定的酸度下將砷元素各形態(tài)還原為氫化物。研究了KBH4溶液濃度對砷形態(tài)峰面積的影響。從圖4可知，當KBH4濃度為20 g/L和40 g/L時，各組分的峰面積相對較高。考慮到40 g/L時“氫化反應”較劇烈，基線波動較大，最終選擇了20 g/L的KBH4作為還原劑。當KBH4濃度為10 g/L時，響應值都偏低，這可能是由于氫化反應效率較低；當KBH4濃度較高時，可能是由于反應過程中產(chǎn)生的大量氫氣稀釋了原子化器中砷原子的濃度，使得峰面積偏低。

圖4 還原劑濃度對峰面積的影響Figure 4 Effect of concentration of reducing agent on the peak area.

2.1.3.3 載氣

實驗研究了載氣流速對各組分峰面積的影響。從圖5可知，隨著載氣流速的增加，各組分的峰面積都逐漸降低，當載氣流速為200 mL/min時各組分的峰面積最大；在實驗中發(fā)現(xiàn)流速為200 mL/min時，會引起較大的基線噪聲和漂移。隨著流速的繼續(xù)增高，原子蒸汽被稀釋，峰面積值降低。最終，選取300 mL/min為載氣流速。

圖5 載氣流速對峰面積的影響Figure 5 Effect of speed of carrier gas on the peak area.

2.1.3.4 屏蔽氣

屏蔽氣能保持火焰形狀穩(wěn)定。研究了屏蔽氣流速對各組分峰面積的影響。從圖6圖可知，屏蔽氣流速為900 mL/min時，4個組分的峰面積均最大。因此，選用900 mL/min為屏蔽氣流速。

圖6 屏蔽氣流速對峰面積的影響Figure 6 Effect of speed of shieldinggas on the peak area.

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍與檢出限

考察方法的線性范圍和檢出限(以3倍的基線噪聲比計)，結果見表3。配制一系列砷形態(tài)的標準樣品：濃度為2、4、6、8和10 ng/mL，繪制標準曲線，結果表明，各組分在測定范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.998 8。檢出限分別為0.29、0.47、0.62和1.16 ng/mL。

2.2.2 精密度實驗

對同一濃度的砷形態(tài)標準溶液連續(xù)進樣7次，將峰面積測定結果列于表4中，以峰面積RSD衡量定量重現(xiàn)性。從表4可知，峰面積RSD均低于3.1%，表明方法重現(xiàn)性較好。

表3 線性范圍與檢出限

表4 方法精密度實驗

2.3 實際樣品分析

按照實驗方法分析3個市售大米樣品以及2個糙米樣品，將分析結果匯總于表5中。從表5數(shù)據(jù)可知，在所測定的樣品中，As(III)都有檢出、DMA和As(V)部分檢出、MMA均為未檢出，且所有樣品中總無機砷的含量均未超過“GB 2762—2012”中規(guī)定的限定值[10](該標準中稻谷、糙米、大米中總無機砷的限量為0.2 mg/kg)。

表5 樣品測定結果

另外，對稻米標準物質進行測定，該標準物質證書中總無機砷為(0.298±0.008) mg/kg，二甲基砷酸為(0.018 6±0.000 8) mg/kg。實際測定總無機砷的含量為0.297 mg/kg，DMA的含量為0.019 mg/kg，可見結果都在不確定度范圍內，說明該方法對無機砷的測定結果準確。

同時，對市售大米樣品和糙米樣品進行加標回收實驗，添加水平為2 ng/mL和4 ng/mL，并將加標回收結果列于表6和表7中。結果表明，4個組分在兩類樣品中的回收率都較好，回收率為85.1%～113%。

表6 市售大米1加標回收測定結果

2.4 方法比較

建立的微波提取法與GB 5009.11—2014的對比結果見表8。從該表8可知，本實驗所選擇的微波提取法，前處理時間短、分析速度快，使用的載流和還原劑濃度也較低。

表7 糙米樣品1加標回收測定結果

表8 方法比較

3 結論

對GB 5009.11—2014中的樣品前處理方法及砷形態(tài)測定的影響因素進行了優(yōu)化研究。建立了更加高效環(huán)保的微波提取法，在最優(yōu)條件下對稻米樣品進行了測定，通過方法學考察和加標回收等實驗，驗證了該方法的有效性。結果表明該方法的線性范圍、檢出限、精密度和加標回收率等指標均良好，說明改進的方法完全可以用于稻米中砷形態(tài)的測定。