滿(mǎn)麗莉,向殿軍
1(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼,028042)2(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼,028042)
食品安全是人類(lèi)健康的重要保證,食品腐敗變質(zhì)不僅會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病[1]。鼠傷寒沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、志賀氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等是引起食品腐敗變質(zhì)和食物中毒的主要原因[2]。新型生物防腐劑-乳酸菌細(xì)菌素的應(yīng)用有利于抑制微生物污染、延長(zhǎng)食品貨架期、改善食品質(zhì)量和提升食品安全[3]。但目前商品化的乳酸菌細(xì)菌素的數(shù)量極其有限,抑菌譜窄和抑菌特性不穩(wěn)定是影響乳酸菌細(xì)菌素應(yīng)用的主要原因之一,篩選出廣譜且抑菌特性穩(wěn)定的乳酸菌細(xì)菌素是亟待解決的問(wèn)題。
植物乳桿菌作為一種乳酸菌細(xì)菌素生產(chǎn)菌株具有許多優(yōu)勢(shì),其來(lái)源廣泛,可從牛乳、肉及肉制品、奶酪、面團(tuán)、發(fā)酵黃瓜、橄欖菜、酸菜、果汁等食物中分離篩選,安全性高[4]。相關(guān)報(bào)道顯示,某些植物乳桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌能有效地抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌(包括致病菌和腐敗菌),同時(shí)具有較好的穩(wěn)定性,例如:plantaricin KL-1Y、plantaricin LpU4和plantaricin MG[5-7]。鑒于植物乳桿菌細(xì)菌素的廣譜抑菌活性和各種環(huán)境下的穩(wěn)定性,其在食品防腐及食品安全方面具有潛在的應(yīng)用前景。
本研究以?xún)?nèi)蒙古自治區(qū)的酸馬奶中篩選到的植物乳桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素為研究對(duì)象,對(duì)其抑菌譜、作用方式、分子質(zhì)量及對(duì)溫度、pH、有機(jī)溶劑、表面活性劑的耐受性進(jìn)行分析。明確該細(xì)菌素的抑菌特性,有利于其作為一種新型的生物防腐劑更好地應(yīng)用于食品中,為更好地實(shí)現(xiàn)細(xì)菌素的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和方法參考。
1.1.1 供試樣品及模式菌株
植物乳桿菌MXG-68分離于內(nèi)蒙古地區(qū)的酸馬奶中,由實(shí)驗(yàn)室自行保存。指示菌株分別購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所、中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心、美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所及波斯模式培養(yǎng)物研究所。
1.1.2 試劑、培養(yǎng)基及主要儀器設(shè)備
培養(yǎng)基,購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司;過(guò)氧化氫酶,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Marker,購(gòu)自寶生物工程(上海)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
MJ-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋,北京天賜科儀商貿(mào)有限公司;Microfuge16型離心機(jī),美國(guó)貝克曼公司;110-801型三量ip67防水原點(diǎn)數(shù)顯卡尺不銹鋼零點(diǎn)電子游標(biāo)尺,東莞市景有模具五金有限公司;DYY-10C型電泳儀、DYCZ-28A型電泳槽,北京市六一儀器廠;1708195型凝膠成像系統(tǒng),伯樂(lè)(Bio-Rad)公司。
1.2.1 培養(yǎng)及發(fā)酵方法
植物乳桿菌MXG-68的培養(yǎng)方法:挑取菌株接種于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基(pH 5.8)的250 mL錐形瓶中,37 ℃培養(yǎng)至約109CFU/mL。
植物乳桿菌MXG-68的發(fā)酵方法:將菌液按1%接種于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基(pH 5.8)的250 mL錐形瓶中,30 ℃發(fā)酵24 h。
指示菌的培養(yǎng)方法:挑取指示菌接種于裝有100 mL 培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,37 ℃培養(yǎng)至約107CFU/mL。植物乳桿菌、清酒乳桿菌及嗜酸乳桿菌用MRS培養(yǎng)基;乳酸乳球菌用M17培養(yǎng)基;產(chǎn)氣莢膜梭菌及生孢梭菌用RCM培養(yǎng)基;單核細(xì)胞增生李斯特氏菌用TSA-YE培養(yǎng)基;糞腸球菌、銅綠假單胞菌及腸炎沙門(mén)氏菌用LB培養(yǎng)基;其他指示菌均用NB培養(yǎng)基。
1.2.2 發(fā)酵上清液的制備及抑菌活性的測(cè)定
部分純化細(xì)菌素的分子質(zhì)量通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定[8]。電泳結(jié)束后,一塊膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色,染色約20 min后用脫色液振蕩過(guò)夜脫色。另一塊膠用無(wú)菌水清洗后,覆蓋于含鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028(107CFU/mL)的NB半固體培養(yǎng)基上,于37 ℃培養(yǎng)12 h觀察特異性條帶處是否出現(xiàn)抑菌圈。
1.2.3 植物乳桿菌MXG-68的抑菌譜測(cè)定
按照1.2.1、1.2.2中的方法制備發(fā)酵上清液,測(cè)定其對(duì)29株指示菌的抑菌活性,確定植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌譜。
1.2.4 細(xì)菌素的作用方式測(cè)定
指示菌蠟樣芽孢桿菌ATCC 11788和鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028分別培養(yǎng)4 h,2株菌的菌液分別分成100 mL的兩等份,一份作為對(duì)照,一份加入部分純化的細(xì)菌素(質(zhì)量濃度0.5 g/L),于37 ℃培養(yǎng)14 h, 每隔1 h取樣測(cè)定指示菌的活菌數(shù)(CFU/mL)和菌體密度(OD600),分析細(xì)菌素對(duì)指示菌的作用方式是殺菌、溶菌,還是抑菌。
1.2.5 細(xì)菌素的分子質(zhì)量測(cè)定
部分純化細(xì)菌素的分子質(zhì)量通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定[8]。出現(xiàn)特異條帶部分的膠體用無(wú)菌水清洗后,覆蓋于含鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028(107CFU/mL)的NB半固體培養(yǎng)基上,于37 ℃培養(yǎng)12 h觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。
1.2.6 細(xì)菌素對(duì)溫度、pH、有機(jī)溶劑和表面活性劑的耐受性測(cè)定
按照1.2.1、1.2.2中的方法制備發(fā)酵上清液,用于細(xì)菌素耐受性的研究。5 mL的發(fā)酵上清液分別于60、80、100、121 ℃處理30 min,4、-20 ℃處理30 d,溫度恢復(fù)到室溫后測(cè)定抑菌活性,以鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028作為指示菌,對(duì)照為室溫下未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液,確定細(xì)菌素的溫度耐受性。
用1 mol/L的HCl或NaOH將發(fā)酵上清液的pH分別調(diào)至1.0~10.0,于37 ℃處理2 h后,將pH重新調(diào)至7.0測(cè)定抑菌活性,以鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028作為指示菌,對(duì)照為37 ℃處理2 h未調(diào)整pH的發(fā)酵上清液,確定細(xì)菌素的pH耐受性。
發(fā)酵上清液分別添加1%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈,1 g/L的Tween-80、Tween-20、Triton X-100及0.1、1.0、5.0 g/L的EDTA,于37 ℃處理2 h后測(cè)定抑菌活性,以鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028作為指示菌,對(duì)照為37 ℃處理2 h的未添加有機(jī)溶劑和表面活性劑的發(fā)酵上清液,確定細(xì)菌素對(duì)有機(jī)溶劑和表面活性劑的耐受性。
1.2.7 數(shù)據(jù)分析
所有的試驗(yàn)均重復(fù)3次,采用Excel進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
大部分植物乳桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素只能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌,如plantaricin W、乳桿菌LL441所產(chǎn)的plantaricin C、plantaricin D及plantaricin T,某些植物乳桿菌可產(chǎn)廣譜細(xì)菌素[9-10]。植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)的細(xì)菌素不但對(duì)金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、生孢梭菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、痢疾志賀氏菌、藤黃微球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌具有抑菌作用,而且對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌等革蘭氏陰性菌亦具有抑制作用(表1和圖1),是一種可抑制常見(jiàn)食品腐敗菌和致病菌的廣譜細(xì)菌素。此結(jié)果與MAN、AGALIYA、YU的研究相一致[11-13]。
表1 植物乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)指示菌的抑菌活性Table 1 The activity of bacteriocins produced by L. plantarum MXG-68 based on indicator strains
注:aNB:營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基; RCM:強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基; TSA-YE:含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂; MRS:De man-Rogosa-Sharpe medium的縮寫(xiě); LB:9Luria-Bertani medium的縮寫(xiě);bG+:革蘭氏陽(yáng)性菌; G-:革蘭氏陰性菌;cATCC:美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所; PTCC:波斯模式培養(yǎng)物研究所Type Culture Collection; NICPBP:中國(guó)藥品生物制品檢定所; CGMCC:中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心?!?”表示未檢出。
a-為鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028;b-葡萄球菌ATCC12600; c-枯草芽孢桿菌ATCC6051圖1 植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)指示菌的抑菌圈Fig.1 Inhibition zone of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum MXG-68 on indicator strains
圖2表明植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)蠟樣芽孢桿菌ATCC 11788(革蘭氏陽(yáng)性菌)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028(革蘭氏陰性菌)的作用方式。與對(duì)照組相比,加入細(xì)菌素后(5~14 h)蠟樣芽孢桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的活菌數(shù)顯著降低(P<0.01)。加入細(xì)菌素后(5~14 h)蠟樣芽孢桿菌ATCC 11788和鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液的OD600變化不明顯(P>0.05),而對(duì)照組菌液的OD600持續(xù)上升。細(xì)菌素導(dǎo)致蠟樣芽孢桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌活菌數(shù)減少,說(shuō)明細(xì)菌素的作用方式是殺菌,而OD600未降低,菌液中總菌數(shù)基本保持不變,說(shuō)明作用方式不是溶菌。
a-為蠟樣芽孢桿菌ATCC 11788;b-鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028圖2 植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)蠟樣芽孢桿菌ATCC 11788和鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028活菌數(shù)及菌體密度的影響Fig.2 Effects of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum MXG-68 on viable cell numbers and cell densities of Bacillus cereus ATCC 11788 and Salmonella Typhimurium ATCC 14028
SDS-PAGE結(jié)果顯示在約6.5 ku獲得一條清晰的條帶,抑菌試驗(yàn)表明該條帶對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028具有抑菌活性(圖3)。植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素的分子質(zhì)量與GUPTA等的研究結(jié)果相一致[14],而與KUMAR等(約6 ku)[15]、李景良(約4 ku)[16]和魯淵(約5 ku)[17]的研究結(jié)果不同,植物乳桿菌分子質(zhì)量的差異可能是由于菌株差異所造成的。
圖3 SDS-PAGE分析及抑菌活性檢測(cè)Fig.3 Tricine-SDS-PAGE analysis and determination of antibacterial activity注:1-部分純化細(xì)菌素的分子質(zhì)量;2-細(xì)菌素對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028的抑菌圈,箭頭表示抑菌圈。
食品在加工、運(yùn)輸、銷(xiāo)售和貯藏過(guò)程中,無(wú)法避免地會(huì)遇到各種高溫和低溫環(huán)境,較好的溫度耐受性是細(xì)菌素被廣泛應(yīng)用于食品中的前提條件之一。由圖4可知,60、80、100、121 ℃處理30 min導(dǎo)致細(xì)菌素的抑菌活性有所降低,但影響不顯著(P>0.05),抑菌活性均保留97.69%以上,結(jié)果表明植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素具有較高的溫度耐受性,此研究結(jié)果與植物乳桿菌F1所產(chǎn)細(xì)菌素相類(lèi)似[18]。同時(shí),細(xì)菌素在冷藏溫度4 ℃和冷凍溫度-20 ℃條件下處理30 d,抑菌活性保留近100%。
圖4 溫度對(duì)抑菌活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the antibacterial activity
由圖5可知,細(xì)菌素在pH 1~10均表現(xiàn)出抑菌活性,最高抑菌活性出現(xiàn)在pH=6。與對(duì)照組相比,當(dāng)pH=1~2時(shí)抑菌活性極顯著性降低(P<0.01),pH=3或10時(shí)抑菌活性顯著性降低(P<0.05),pH=4~9時(shí)對(duì)抑菌活性影響不顯著(P>0.05),但抑菌活性均保留94.55%以上,說(shuō)明植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素具有較好的酸堿耐受性。此結(jié)果與以前的部分研究結(jié)果不同,細(xì)菌素僅在酸性環(huán)境下有抑菌活性,而在中性和堿性環(huán)境下抑菌活性喪失[19-20]。細(xì)菌素的pH耐受性強(qiáng)有助于其在食品加工和進(jìn)入人體過(guò)程中,最大程度地保留其抑菌活性,有利于更好地延長(zhǎng)保質(zhì)期及發(fā)揮益生特性。
圖5 不同pH對(duì)抑菌活性的影響Fig.5 Effect of different pH vaule on the antibacterial activity
由圖6可知,與對(duì)照組相比,乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈導(dǎo)致植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌活性稍有降低,但影響不顯著(P>0.05)。經(jīng)不同的有機(jī)溶劑處理后,抑菌活性保留近100%,具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性,結(jié)果表明細(xì)菌素可在純化的不同階段維持其固有的結(jié)構(gòu)和功能,有利于細(xì)菌素的提取及廣泛應(yīng)用。
圖6 有機(jī)溶劑對(duì)抑菌活性的影響Fig.6 Effect of organic solvents on the antibacterial activity
由圖7可知,與對(duì)照組相比,Tween-80、Tween-20和Triton X-100對(duì)植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌活性基本無(wú)影響(P>0.05)。EDTA有利于提高細(xì)菌素的抑菌活性,且1 g/L和5 g/L EDTA能顯著提高抑菌活性(P<0.01),此結(jié)果與黎杰、滕志利的研究結(jié)果相一致[21-22]。對(duì)于革蘭氏陰性菌,EDTA增強(qiáng)抑菌活性主要原因在于其可發(fā)揮外膜滲透劑的作用,絡(luò)合脂多糖維持其結(jié)構(gòu)所需的Ca2+,破壞其結(jié)構(gòu);而對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用主要是在于其可與金屬離子螯合[23]。
圖7 表面活性劑對(duì)抑菌活性的影響Fig.7 Effect of surfactants on the antibacterial activity
酸馬奶來(lái)源的植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)的細(xì)菌素以殺菌的方式同時(shí)抑制常見(jiàn)的易導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)和食物中毒的微生物,包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌,是一種分子質(zhì)量約6 ku的廣譜細(xì)菌素,其在高溫、冷藏、冷凍、酸性、中性、堿性條件下均較穩(wěn)定,且有機(jī)溶劑及表面活性劑對(duì)細(xì)菌素的抑菌活性基本無(wú)影響,而EDTA有利于提高抑菌活性,說(shuō)明該細(xì)菌素的穩(wěn)定性較高,在應(yīng)對(duì)食品加工、貯藏、運(yùn)輸、銷(xiāo)售過(guò)程中能最大程度地保留抑菌活性,延長(zhǎng)食品的貨架期,為更好地實(shí)現(xiàn)細(xì)菌素的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)及蛋白組學(xué)的不斷發(fā)展,可更加透徹地掌握乳酸菌細(xì)菌素合成相關(guān)基因、調(diào)控機(jī)制及代謝通路,有利于更加有效的應(yīng)用乳酸菌細(xì)菌素。