李雪雪 郭雯巖 周璇 趙偉 牛鐵泉 紀薇

摘要：為提高鮮食葡萄苗木品質和良種繁育速度，以鮮食葡萄品種晶紅寶為試驗材料，探究培養(yǎng)基天然營養(yǎng)添加物的種類及濃度、外植體消毒時間、光周期、微嫁接方法和綁縛材料等因素對葡萄微嫁接苗成活率的影響，結合響應面法確定葡萄微嫁接苗組培最佳試驗條件，優(yōu)化葡萄微嫁接組培快繁體系。結果表明，MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂培養(yǎng)基（pH 5.8～6.0）中添加香蕉泥可顯著降低微嫁接苗的褐變率和污染率，促進不定根的伸長。響應面分析進一步確定了葡萄微嫁接組培的最佳試驗條件為氯化汞消毒7.1 min，光照17 h，香蕉泥濃度700 mg/L。在此基礎上采用劈接法、錫箔紙作綁縛材料的葡萄微嫁接苗成活率顯著高于其他處理。

關鍵詞：葡萄;組織培養(yǎng);微嫁接;響應面分析

中圖分類號：S663.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）09-0069-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.016? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： In order to improve the quality of fresh grape seedlings and the breeding speed of fresh varieties， the fresh grape variety Jinghongbao was used as the experimental material to explore the effects of factors such as the type and concentration of natural nutrient additives， disinfection time of explants， photoperiod， micro-grafting methods and binding materials on the survival rate of grape micro-grafted seedlings. The best experimental conditions for grape micro-grafted seedlings were determined by response surface methodology， and the grape micro-grafting tissue culture rapid propagation system was optimized. The results showed that the addition of banana mud in MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L sucrose+7.0 g/L agar medium（pH 5.8～6.0） could significantly decrease the browning rate and pollution rate of micro-grafted seedlings and promote the elongation of adventitious roots. The response surface analysis further confirmed that the optimal experimental conditions for grape micro-grafting tissue culture were： HgCl2 disinfection time 7.1 min， light time 17 h， banana mud concentration 700 mg/L. On this basis， the survival rate of grape micro-grafted seedlings using the splicing method and tin foil as the binding material was significantly higher than other treatments.

Key words： grape; tissue culture; micrografting; response surface analysis

中國是葡萄（Vitis spp.）生產大國，截至2018年底葡萄產量已達845.0萬t[1]。中國葡萄生產以鮮食葡萄為主，品種單一和苗木質量參差不齊是限制中國葡萄產業(yè)發(fā)展的主要原因，優(yōu)質高效標準化栽培模式及管理技術對于葡萄現(xiàn)代化產業(yè)發(fā)展具有重要意義[2]。葡萄微嫁接技術是葡萄組織培養(yǎng)與嫁接繁殖技術的結合，具有周期短、效率高、不受季節(jié)限制和環(huán)境影響等優(yōu)點[3]，自1972年Murashige等創(chuàng)立微芽嫁接技術以來，微嫁接技術已廣泛應用于研究良種保存、植物檢疫、砧穗親和性、信號傳導以及離體繁殖等領域[4]。因此，建立有效的鮮食葡萄微嫁接苗組培快繁體系是修復葡萄組織培養(yǎng)畸形發(fā)育及繁殖無毒苗木的基礎。

常規(guī)的組培快繁體系包括外植體的接種、初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)等環(huán)節(jié)，微嫁接組培快繁體系在此基礎上還涵蓋微嫁接苗的建立及培養(yǎng)等技術。葡萄微嫁接苗的成活率受多種因素影響[5]，單獨利用某種因素優(yōu)化組培快繁體系較為片面。響應面（Box-Behnken design，BBD）法可在各環(huán)節(jié)單因素預試驗條件包括最佳設計的前提下，通過對自變量和組培苗成活率的關系建立模型并進行綜合分析，得到可靠的試驗因素優(yōu)化方案[6]。

本試驗以鮮食葡萄品種晶紅寶為試驗材料，采用響應面法研究無菌外植體的消毒、組培光周期和培養(yǎng)基的成分及配比對葡萄微嫁接苗成活率的影響，結合適宜的微嫁接方法和最佳綁縛材料，建立并優(yōu)化適用于葡萄微嫁接的組培快繁體系，為有關葡萄微嫁接的研究提供了良好的試驗系統(tǒng)，同時也為鮮食葡萄良種保存和苗木繁育提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? ?試驗材料

于2017年7月在山西農業(yè)大學園藝站（37°25′21″ N，112°34′45″ E，803 m）采集晶紅寶嫩梢作為優(yōu)化葡萄微嫁接快繁體系的試驗材料。試材采用籬架式種植，栽植密度為1.0 m×1.6 m，常規(guī)管理。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 外植體的消毒與培養(yǎng)? 清晨露水未干時剪取健康的葡萄幼嫩莖段，流水沖洗2 h去除灰塵和蟲卵，剪成約5 cm的莖段作為外植體，在超凈工作臺內進行表面消毒。具體消毒方法為：75%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次，0.1%的氯化汞浸泡后，無菌水沖洗5次。試驗設計0.1%的氯化汞處理時間分別為6、8和10 min，處理后的莖段用滅菌的濾紙吸去表面水分備用。

將消毒后的材料截成約2 cm的單芽莖段，切去兩端切口部位，接種于MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂培養(yǎng)基（pH 5.8～6.0）上，置于組培室培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境溫度為（25±1） ℃，光照度為2 000 lx，光周期16 h/8 h（光/暗），10 d后觀察記錄葡萄組培苗的生長情況，并統(tǒng)計成活率、褐變率和污染率。

1.2.2? 葡萄組培苗的微嫁接? 葡萄外植體培養(yǎng)6周后剪取單芽莖段，采用3種不同方法進行微嫁接，7 d后觀察統(tǒng)計成活率、褐變率及污染率。具體微嫁接方法如下。

1）劈接法。砧木切除芽節(jié)上的腋芽及葉片，上端縱切0.4 cm，接穗形態(tài)學基端縱切0.5 cm長的楔形，直接插入砧木的接口中，嫁接部位緊密不偏，包裹好接口處，接入培養(yǎng)基中。

2）圓孔接法。使用解剖針在砧木頂端切口扎深0.4 cm的圓孔，接穗基端削尖插入圓孔，接合緊密，接入培養(yǎng)基中。

3）“L”形接法。在砧木頂端向下縱切0.4 cm，截去一側組織使頂端呈“L”形，接穗切成倒“L”形，將砧木和接穗的切口契合，接口包裹緊密，接入培養(yǎng)基中。

采用上述試驗中最適宜的方法進行葡萄的微嫁接，選取錫箔紙、嫁接夾、Parafilm膜、吸管和鋁片5種綁縛材料對微嫁接苗接口進行綁縛，7 d后觀察統(tǒng)計成活率、褐變率及污染率。

1.2.3? MS培養(yǎng)基添加天然營養(yǎng)物質培養(yǎng)葡萄微嫁接苗? 將葡萄微嫁接苗接種在添加500 mg/L不同天然營養(yǎng)物質（香蕉泥、棗泥、馬鈴薯泥、番茄泥、椰粉）的MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂培養(yǎng)基（pH 5.8～6.0）上，香蕉泥、棗泥、馬鈴薯泥與番茄泥均常溫研磨，椰粉為常溫沖泡，以不添加天然營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基作空白對照。記錄各處理下微嫁接苗的成活情況、生根情況和葉片數(shù)。

選取上述處理中微嫁接苗成活率最高的天然營養(yǎng)添加物，進一步設置濃度分別為250、500、750、1 000 mg/L的處理，觀察統(tǒng)計微嫁接苗相關數(shù)據(jù)，探究培養(yǎng)基中添加該天然營養(yǎng)物質的最適濃度。

1.2.4? 不同光周期環(huán)境培養(yǎng)葡萄微嫁接苗? 設置不同的葡萄微嫁接苗培養(yǎng)光周期，分別為8 h/16 h、 14 h/10 h、16 h/8 h和24 h/0 h（光/暗），10 d后觀察統(tǒng)計微嫁接苗的成活率、褐變率和污染率。

1.2.5? 響應面法優(yōu)化葡萄微嫁接組培快繁技術? 在前期單因素試驗結果的基礎上，選取氯化汞消毒時間（A）、光照時間（B）和天然營養(yǎng)物質濃度（C）3個因素為響應曲面模型的自變量，每個自變量設置3個水平，分別編碼為-1、0和1，以葡萄微嫁接苗的成活率為響應值進行響應面分析，試驗方案設計見表1。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

試驗采用單因素隨機處理，設3組生物學重復。利用Excel 2013和SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，Design-Expert 8.0.6軟件設計分析響應曲面模型。

2? 結果與分析

2.1? 氯化汞消毒時間對葡萄微嫁接苗生長的影響

由表2可知，氯化汞消毒時間長短對葡萄組培苗的成活率、褐變率和污染率均有顯著影響。經氯化汞處理8 min的葡萄微嫁接苗成活率顯著高于其他2個處理，褐變率顯著低于其他2個處理。長時間的氯化汞消毒可顯著降低葡萄微嫁接苗的污染率，同時由于消毒劑對植物的影響，外植體褐變率顯著升高。綜合比較得出，氯化汞處理8 min消毒效果較好。

2.2? 微嫁接方法對葡萄微嫁接苗生長的影響

不同微嫁接方法對葡萄微嫁接苗生長的影響差異顯著（圖1）。采用劈接法的葡萄微嫁接苗成活率顯著高于“L”形接法和圓孔法，褐變率和污染率顯著低于“L”形接法和圓孔法。因此，劈接法為葡萄微嫁接的最佳方法。

2.3? 綁縛材料對葡萄微嫁接苗生長的影響

不同綁縛材料對葡萄微嫁接苗生長的影響如圖2所示。使用錫箔紙作為綁縛材料的微嫁接苗成活率顯著高于嫁接夾、Parafilm膜、吸管和鋁片處理，而褐變率顯著低于嫁接夾、吸管和鋁片處理;使用吸管作為綁縛材料的微嫁接苗成活率顯著低于其他處理（Parafilm膜除外），褐變率顯著高于其他處理;使用Parafilm膜作綁縛材料則導致葡萄微嫁接苗的污染率顯著增加。綜上可見，錫箔紙是葡萄微嫁接的最佳綁縛材料。

2.4? 天然營養(yǎng)物質對葡萄微嫁接苗生長的影響

在MS培養(yǎng)基中添加不同天然營養(yǎng)物質時，葡萄微嫁接苗的生長情況也存在顯著差異（表3）。與不添加營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基中微嫁接苗（空白對照）相比，添加香蕉泥可顯著降低葡萄微嫁接苗的褐變率和污染率，提高平均根數(shù)和根長，但微嫁接苗成活率和葉片數(shù)無顯著變化;添加棗泥可顯著降低葡萄微嫁接苗的污染率，促進不定根的伸長;添加馬鈴薯泥培養(yǎng)的微嫁接苗成活率無顯著變化，但褐變率和平均根長顯著降低，污染率顯著高于空白對照;添加番茄泥培養(yǎng)的微嫁接苗污染率顯著高于空白對照，平均根長顯著低于對照;添加椰粉后微嫁接苗的褐變率顯著高于空白對照，其他指標無顯著變化。結果表明，MS+香蕉泥最適用于葡萄微嫁接組織培養(yǎng)，可有效提高微嫁接苗成活率，促進植株生長。

進一步對添加香蕉泥的濃度進行探究得出，添加500和750 mg/L香蕉泥可顯著提高葡萄微嫁接苗的成活率和不定根的數(shù)量及長度，而添加500 mg/L香蕉泥培養(yǎng)的微嫁接苗褐變率顯著低于其他處理（表4）。因此，MS+500 mg/L香蕉泥為葡萄微嫁接組培快繁體系最佳培養(yǎng)基。

2.5? 光周期對葡萄微嫁接苗生長的影響

不同光周期對葡萄微嫁接苗生長情況的影響存在顯著差異（表5）。16 h/8 h光照時葡萄微嫁接苗成活率為50.5%，顯著高于其他光周期處理，同時褐變率顯著低于其他光周期處理。24 h/0 h光照環(huán)境顯著降低了葡萄微嫁接苗的成活率，但污染率顯著高于其他處理，其他處理的污染率之間差異不顯著。因此，適度的暗處理對葡萄微嫁接苗的生長發(fā)育是十分必要的，16 h/8 h光照環(huán)境可保證較高的成活率，適用于葡萄微嫁接苗的組織培養(yǎng)。

2.6? 響應面法優(yōu)化葡萄微嫁接組培快繁體系

2.6.1? 回歸方程擬合與響應面分析? 選擇氯化汞消毒時間、光照時間和香蕉泥濃度作為響應面試驗的自變量，按照三因素三水平的響應面試驗設計方案，得出試驗數(shù)據(jù)如表6所示。利用Design-Expert軟件擬合試驗結果得出響應面試驗回歸方程Y=62.60-9.82A+1.95B+8.23C-0.75AB+0.30AC+1.25BC-10.95A2-12.20B2-10.45C2。

由表7可知，模型的P值=0.000 1<0.01，表明模型與3個自變量的線性關系極顯著，失擬項P值為0.301 0>0.05，且回歸方程R2=0.970 9，表明該方程擬合良好，結果可靠。3個自變量對葡萄微嫁接苗成活率的影響排序為氯化汞消毒時間>香蕉泥濃度>光照時間。

如圖3所示，表示不同試驗因素間交互作用的等高線形狀越接近橢圓形，因素之間的交互作用越顯著，越接近圓形則交互作用顯著性越低[7]。由圖3可以看出，光照時間和香蕉泥濃度的交互作用明顯，在三維立體圖中出現(xiàn)最高值，且該值出現(xiàn)在較長的光照時間（16～20 h）和較高的香蕉泥濃度（500～750 mg/L）范圍內。

2.6.2? 模型最優(yōu)試驗條件的推斷及驗證? 通過對響應面曲線和回歸方程的分析，得到葡萄微嫁接苗成活率最高的試驗條件為：氯化汞消毒時間7.11 min，光照時間16.92 h，香蕉泥濃度697.09 mg/L，在此條件下葡萄微嫁接苗成活率預測值為66.527 6%。

在最佳試驗條件的基礎上設置氯化汞消毒時間7.1 min，光照時間17 h，香蕉泥濃度700 mg/L進行驗證試驗，得到葡萄微嫁接苗的成活率為（65.2±0.8）%，與預測值無顯著差異，證明響應面法可有效優(yōu)化葡萄微嫁接組培快繁技術體系。

3? 討論

外植體的表面消毒是葡萄組培快繁的第一步，外植體消毒試劑種類較多，實際應用中常為追求更好的消毒效果而忽略消毒時間對外植體的影響，易造成消毒時間過長，毒害植物，降低外植體成活率[8，9]。氯化汞消毒耗時短，本試驗采用0.1%的氯化汞溶液浸泡外植體，不僅對于降低葡萄外植體的污染效果顯著，還可避免高濃度試劑的高毒性對試驗人員造成傷害。

培養(yǎng)基的成分配比和培養(yǎng)環(huán)境對葡萄微嫁接苗增殖和生根影響顯著[10，11]。方中明等[12]通過探究天然添加物對鐵皮石斛類原球莖增殖、分化及生根的影響，確定香蕉汁和馬鈴薯汁均有利于鐵皮石斛小苗生根。葡萄的組織培養(yǎng)中也常用天然營養(yǎng)物質為植株生長提供所需要的氨基酸和微量元素，促進側芽萌發(fā)[13]，但具體種類與比例的選擇尚無統(tǒng)一有效的方案。本試驗中，接種于添加500 mg/L香蕉泥的MS培養(yǎng)基中的葡萄微嫁接苗成活情況顯著優(yōu)于其他處理，證明香蕉泥是葡萄組織培養(yǎng)的理想天然營養(yǎng)添加物。

微嫁接的具體操作是葡萄微嫁接組培快繁體系的重要環(huán)節(jié)[14]。目前常用的嫁接方法有劈接法、皮接法、“L”型接法和圓孔接法等，部分方法對接穗和砧木的莖粗有較高要求，操作困難且適用性有限[15];微嫁接苗砧穗接口的綁縛材料多選用移液槍頭和硅膠管，這類材料操作便利，可以及時觀察接口的愈合程度，Parafilm膜和嫁接夾成本高，且具有透光、導熱和熔點低，難以高溫滅菌等缺點，難以適應不同粗細微嫁接苗的綁縛要求，增加操作難度和污染風險[16]。本試驗最終采用劈接法，并選用錫箔紙作綁縛材料，顯著提高了葡萄微嫁接苗的成活率，進一步完善了葡萄微嫁接組培快繁技術體系。

響應面法是一種引入數(shù)理統(tǒng)計在內的試驗設計優(yōu)化方法，通過編碼自變量水平設計響應面試驗方案，并得出試驗結果與所有自變量的回歸方程[17]。響應面法建立的預測模型考慮到單個自變量影響的同時，還通過對模型適應性和顯著性的檢驗分析，利用等高線圖和3D圖體現(xiàn)出自變量之間的交互作用[18]。本試驗探究了外植體表面消毒時間、培養(yǎng)基天然營養(yǎng)添加物的種類和濃度及組培光周期對葡萄微嫁接苗成活情況的影響，采用響應面法進行分析，并結合微嫁接方法和綁縛材料的選擇，得到葡萄微嫁接苗組織培養(yǎng)的最佳試驗條件，建立了葡萄微嫁接組培快繁體系，為改善鮮食葡萄的苗木品質和繁育技術提供理論依據(jù)。

參考文獻：

[1] 王世平，李? 勃.中國設施葡萄發(fā)展概況[J].落葉果樹，2019， 51（1）：1-5.

[2] 王秀芬，劉? 俊，李敬川，等.轉型升級是中國葡萄產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必由之路[J].中外葡萄與葡萄酒，2017（4）：117-123.

[3] HAO X Y，BI W L，CUI Z H，et al. Development，histological observations and Grapevine leafroll-associated virus-3 localisation in in vitro grapevine micrografts： Micrografting of virus-infected grapevine[J].Annals of applied biology，2017，170（3）：379-390.

[4] 馬紹英，劉元衛(wèi)，蘇李維，等.葡萄離體嫁接部位的生理生化變化[J].果樹學報，2016，33（2）：179-186.

[5] 曹寶臣，李? 勝，馬紹英，等.葡萄離體嫁接試管苗的光合特性差異性分析[J].分子植物育種，2016，14（7）：1841-1846.

[6] 楊云舒，李? 榮，姜子濤.響應面試驗優(yōu)化廣棗黃酮的微波提取工藝及黃酮的提純[J].食品科學，2015，36（22）：18-24.

[7] 張? 超，胡蔣寧，范亞葦，等.響應面法優(yōu)化酶催化紫蘇籽油合成富含α-亞麻酸甘油二酯的工藝條件[J].中國農業(yè)科學，2011，44（5）：1006-1014.

[8] 閔首軍，李愛玲.葡萄組織快繁技術研究[J].農學學報，2012， 2（10）：55-57.

[9] 劉? 娜，許? 軻，張? 文，等.四個釀酒葡萄品種組培快繁體系的初建[J].植物生理學報，2013，49（10）：1071-1076.

[10] 蔡文博，段? 虹，王? 軍，等.4個鮮食葡萄品種組培快繁體系的建立[J].核農學報，2019，33（2）：248-254.

[11] 黃麗燕，張雅麗，盧? 江.葡萄砧木品種離體快繁研究初報[J].中外葡萄與葡萄酒，2010（5）：14-17.

[12] 方中明，白根祥，曾祺森，等.天然添加物對鐵皮石斛類原球莖增殖、分化及生根的影響[J].北方園藝，2015（21）：107-110.

[13] DIAB A A，KHALIL S M，ISMAIL R M. Regeneration andmicropropagation of grapevine （Vitis vinifera） through shoot tips andaxillary buds[J]. International journal of advanced biotechnology research，2011，2（4）：484-491.

[14] JASKANI M J，HAIDER A，SULTANA R，et al. Effect of growth hormones on micropropagation of Vitis vinifera L. cv. Perlette[J].Pakistan journal of botany，2008，40（1）：105-109.

[15] 陳? 哲，胡福初，范鴻雁，等.荔枝品種間親緣關系與嫁接親和相關性分析[J].分子植物育種，2018，16（24）：8111-8120.

[16] 韓? 曉，劉鳳之，王孝娣，等.3種綜合評價法在葡萄砧穗組合環(huán)境適應性中的應用[J].果樹學報，2017，34（10）：1349-1356.

[17] 李? 莉，張? 賽，何? 強，等.響應面法在試驗設計與優(yōu)化中的應用[J].實驗室研究與探索，2015，34（8）：41-45.

[18] 呂小京，操德群，徐年軍.響應面試驗優(yōu)化酶解法制備海洋微藻微擬球藻抗氧化肽工藝[J].食品科學，2018，39（6）：183-188.

收稿日期：2019-03-04

基金項目：山西省科技重點研發(fā)項目（201703D221014-4）;山西省青年拔尖人才計劃項目（2018）;山西省高等學校優(yōu)秀青年學術帶頭人項目（2017）;山西農業(yè)大學青年拔尖創(chuàng)新人才支持計劃項目（TYIT201401）

作者簡介：李雪雪（1994-），女，山西臨汾人，在讀碩士研究生，研究方向為葡萄微嫁接技術，（電話）18234498356（電子信箱）lishirley1994@163.com;通信作者，牛鐵泉（1964-），男，副教授，碩士研究生導師，博士，主要從事葡萄栽培與種質資源創(chuàng)新研究，（電子信箱）niutiequan@126.com;紀? 薇（1983-），女，副教授，碩士研究生導師，博士，主要從事葡萄栽培與種質資源創(chuàng)新研究，（電子信箱）jiweiputao@163.com。