姚 磊，汪俊杰，金思怡，司馬秀田

顱咽管瘤(craniopharyngioma，CP)現(xiàn)在的主流治療手段是手術(shù)切除[1]，但術(shù)后由于激素的缺少，會引起各種并發(fā)癥，術(shù)后需要額外補(bǔ)充激素，比如生長激素[2]。一般來說，生長激素會促進(jìn)胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor，IGF-I)的局部釋放，從而激活I(lǐng)GF-I受體(IGF-I receptor, IGF-IR)。IGF-IR 最初被認(rèn)為是一種沒有實(shí)質(zhì)性作用的受體，然而在最近幾年已經(jīng)作為一種具有獨(dú)立特征的受體被人們所接受。IGF-IR與細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系，參與癌癥發(fā)生和發(fā)展[3]。然而，其在顱咽管瘤中的作用尚不明確，本研究從IGF-1出發(fā)探討其在顱咽管瘤細(xì)胞增殖中的作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 人顱咽管瘤原代細(xì)胞體外培養(yǎng)手術(shù)中無菌條件下取新鮮、血供好的腫瘤未壞死部分，放入盛有含10%胎牛血清的DMEM/F12中，冰上操作，迅速送至細(xì)胞凈化培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡觀察：將細(xì)胞傳代于底部鋪有載玻片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞獲得良好的貼壁，取出載玻片，Trypan染色計(jì)數(shù)。

1.3 免疫化學(xué)染色鑒定顱咽管瘤細(xì)胞采用免疫酶染色法對培養(yǎng)的CP腫瘤細(xì)胞行角蛋白(CK7)染色，鑒定組織來源，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。應(yīng)用的一抗為CK7和IGF-IR。結(jié)果判讀：隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野，記數(shù)300個(gè)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)著色細(xì)胞的數(shù)目判定染色結(jié)果。參考Kawamato的標(biāo)準(zhǔn)，棕黃色細(xì)胞≤30%為陰性，棕黃色細(xì)胞數(shù)>31%為陽性。

1.4 人顱咽管瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測取指數(shù)生長期中的細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色后確定活細(xì)胞計(jì)數(shù)在95%以上，收集細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105·mL-1，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，實(shí)驗(yàn)組給予終濃度為100 ng·mL-1的IGF-I。對照組只給相應(yīng)的培養(yǎng)介質(zhì)。培養(yǎng)1、3、5和7 d后，采用Trypan法對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并進(jìn)行MTT檢測。

1.5 細(xì)胞免疫組化檢測p-AKT蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為IGF-IR陽性組和陰性組，加用IGF-I 100 ng·mL-1干預(yù)5～10 min后進(jìn)行免疫組化染色，方法同1.3，應(yīng)用一抗為兔抗p-AKT多克隆抗體。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)，定量資料采用t檢驗(yàn)或者單因素方差分析，定性資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CP細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

2.1.1 倒置相差顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)基本一致，早期未貼壁時(shí)為圓形透亮，體積較大。貼壁后，兩種亞型CP細(xì)胞表現(xiàn)有所不同，釉質(zhì)上皮型腫瘤細(xì)胞體積較鱗狀乳頭型腫瘤細(xì)胞體積稍小，似菱形狀，排列呈典型的鋪路石樣，如細(xì)胞密度低則表現(xiàn)為類似寬體的梭形細(xì)胞；鱗狀乳頭型腫瘤細(xì)胞呈多角(邊)型改變，細(xì)胞連接較緊密，如細(xì)胞密度低，則呈圓形或扇形樣伸展。細(xì)胞核為圓形或類圓形，體積較大，核∶質(zhì)約為1∶1，胞質(zhì)豐富，生長較迅速，見圖1。

A：釉質(zhì)上皮型腫瘤；B：鱗狀鱗形乳頭型腫瘤(×200)。圖1 CP細(xì)胞傳代培養(yǎng)的典型表現(xiàn)

2.1.2 細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定顱咽管瘤細(xì)胞以CK7為抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，抗體為胞質(zhì)表達(dá)呈陽性反應(yīng)，因此，所培養(yǎng)細(xì)胞被認(rèn)定為上皮細(xì)胞細(xì)胞來源，見圖2。

胞質(zhì)棕褐色陽性顆粒：A：×200；B：×400。圖2 CP細(xì)胞CK7陽性染色

2.1.3 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測IGF-IR的表達(dá)結(jié)果顯示顱咽管瘤細(xì)胞中IGF-IR陽性表達(dá)為14例，IGF-IR陰性者15例。病理分類顯示，IGF-IR陽性表達(dá)的細(xì)胞為釉質(zhì)上皮型11例和鱗狀乳頭瘤型3例，陽性率為釉質(zhì)上皮性61.1%和鱗狀乳頭瘤型37.5%，二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 IGF-I對CP細(xì)胞增殖的影響

2.2.1 細(xì)胞增殖狀態(tài)及計(jì)數(shù)體外給予IGF-I 100 ng·mL-1干預(yù)培養(yǎng)后，與對照組相比，培養(yǎng)1、3、5和7 d分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)：干預(yù)組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而且，IGF-IR陽性組的細(xì)胞計(jì)數(shù)也明顯多于IGF-IR陰性組的細(xì)胞計(jì)數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖3。

×105·mL-1

注：①與正常培養(yǎng)組比較，P<0.05；②與IGF-1R(-)比較，P<0.05。

A：IGF-IR陽性細(xì)胞，陽性棕色顆粒定位于細(xì)胞膜(SP,×400)；B： IGF-IR陰性的腫瘤細(xì)胞(SP,×200)。圖3 免疫組化顯示IGF-IR在CP細(xì)胞中的表達(dá)

2.2.2 MTT測定結(jié)果體外給予IGF-I后，對照組細(xì)胞OD值0.122±0.023，實(shí)驗(yàn)組中IGF-IR(+)組細(xì)胞OD值0.523±0.012，IGF-IR(-)組細(xì)胞OD值0.349±0.015，與對照組相比。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值明顯增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IGF-IR(+)組與IGF-IR(-)組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 細(xì)胞免疫組化檢測p-AKT蛋白的表達(dá)p-AKT免疫組化陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核呈棕黃色至棕褐色染色。呈核漿型分布，未見單純胞核著色，染色呈淡黃至棕褐色，以彌漫性分布為主，29例CP細(xì)胞在IGF-I干預(yù)后p-AKT蛋白陽性表達(dá)共25例，表達(dá)率為84.50%；未干預(yù)組的表達(dá)共25例，表達(dá)率為41.03%，兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

A：在IGF-IR陽性的細(xì)胞中p-AKT呈強(qiáng)陽性(+++)，陽性棕色顆粒于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)；B：IGF-IR陰性的細(xì)胞中p-AKT呈弱陽性(+)反應(yīng)(SP,×200)。圖4 免疫組化顯示IGF-I干預(yù)后CP細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)

3 討論

顱咽管瘤是一種較為罕見的腦瘤，治愈后復(fù)發(fā)率較高[4]。因其瘤體壓迫腦垂體和下丘腦，在手術(shù)后常常需要長期使用胰島素樣生長因子來進(jìn)行激素治療。但由于顱咽管瘤常常伴隨著高復(fù)發(fā)率，同時(shí)IGF-I已被證實(shí)與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)[5-6]，例如乳腺癌和肝癌。IGF-I與顱咽管瘤細(xì)胞增殖可能有著密切關(guān)系。

作為與胰島素有同源相似性的生長激素代替物，IGF-I在細(xì)胞分化中以及細(xì)胞凋亡的過程中不可或缺[7]。已經(jīng)有研究證明，IGF-I在結(jié)直腸癌和乳腺癌等的發(fā)生中有著一定的作用：結(jié)直腸癌患者血清中的IGF-I水平明顯增高，這與IGF-I促進(jìn)黏附分子的合成有關(guān)[8]；IGF-I能刺激正常乳腺上皮細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)生，通過激活磷脂酰肌醇-3激酶途徑，以及通過磷酸化AKT通路促進(jìn)DNA的合成而使癌細(xì)胞增殖[9]。目前，關(guān)于IGF-1與顱咽管瘤的關(guān)系尚缺少相應(yīng)的文獻(xiàn)。本研究運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT方法檢測IGF-1干預(yù)后細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)IGF-1可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖。

鑒于磷酸化AKT通路在乳腺癌中的作用[9]，IGF-I可能通過磷酸化AKT通路促進(jìn)顱咽管瘤細(xì)胞的增殖。本研究通過免疫組化檢測細(xì)胞中p-AKT蛋白表達(dá)程度，結(jié)果顯示，IGF-I干預(yù)后p-AKT蛋白陽性表達(dá)率明顯增加，提示IGF-I可能通過增加p-AKT蛋白的表達(dá)促進(jìn)顱咽管瘤細(xì)胞增殖，通過干預(yù)p-AKT的表達(dá)有望成為未來顱咽管瘤治療新的靶點(diǎn)。

近年來，顱咽管瘤術(shù)后康復(fù)成為熱門研究方向，但對于影響其康復(fù)效果及其復(fù)發(fā)率的因素的探尋還有限，深入探索新的治療靶點(diǎn)與途徑有助于降低顱咽管瘤的復(fù)發(fā)率。