李海濤，劉艷環(huán)，張斌，苗利光※，趙冬鳳

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112；2.石家莊市獸用生物制品供應(yīng)站，石家莊 050000；3.廊坊職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 廊坊 065000)

三聚氰胺（Melamine，MA）是一種三嗪類雜環(huán)有機(jī)化合物，遇強(qiáng)酸和強(qiáng)堿后水解為三聚氰酸（Cyanuric acid，CYA）。三聚氰胺和三聚氰酸不屬于飼料原料和飼料添加劑，但是由于其含有66.7%的氮，被違法添加，以增加飼料中表觀蛋白氮的含量[1]。近年來，工業(yè)污染、環(huán)境富集導(dǎo)致飼料和獸藥原料污染，這兩種化學(xué)物質(zhì)被不斷發(fā)現(xiàn)在飼料和獸藥中，威脅動(dòng)物健康、構(gòu)成動(dòng)物生產(chǎn)安全隱患。三聚氰胺和三聚氰酸兩者單獨(dú)存在時(shí)對(duì)動(dòng)物機(jī)體的毒性不大，但是混合后對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成的損傷程度加大，尤其是高劑量暴露時(shí)，短時(shí)間內(nèi)沉積在腎小管，造成腎結(jié)石或者腎毒性的發(fā)生[2]。本研究通過三聚氰胺和三聚氰酸混合物對(duì)狐貍大劑量暴露的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，掌握三聚氰胺和三聚氰酸混合物在狐貍體內(nèi)的代謝規(guī)律及對(duì)肝臟、腎臟的損傷程度，為評(píng)估狐貍?cè)矍璋泛腿矍杷峄旌衔镏卸咎峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑和儀器

三聚氰胺和三聚氰酸（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；一次性靜脈采血針、肝素抗凝采血管（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Tedia公司）；氨水、乙酸鉛、三氯乙酸（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；檸檬酸、辛烷磺酸鈉（分析純，Sigma公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Dionex Summit HPLC系統(tǒng)、Acclaim混合基質(zhì)柱WAX-1（戴安公司）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和分組

動(dòng)物試驗(yàn)在河北省冀東動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行。選擇體重接近的成年雄性狐貍12只，品種一致，健康狀況良好。試驗(yàn)狐貍隨機(jī)分為4組，每組3只。Ⅰ組為陰性對(duì)照組，Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組口服不同濃度的三聚氰胺和三聚氰酸混合物，見表1。染毒前動(dòng)物飼養(yǎng)在動(dòng)物舍內(nèi)適應(yīng)5～7d，使其適應(yīng)環(huán)境，自由飲水和采食，按標(biāo)準(zhǔn)正常飼養(yǎng)。試驗(yàn)組動(dòng)物于空腹12 h后染毒。

表1 各組口服三聚氰胺和三聚氰酸的濃度Table 1 The concentrationsof oral melamine and cyanuric acid in each group （mg/Kg）

2 方法

2.1 中毒模型的建立

建立中毒模型前，對(duì)試驗(yàn)用狐貍進(jìn)行分組編號(hào)，并觀察和記錄狐貍的基本狀態(tài)，包括體重、體溫、精神狀態(tài)及黏膜狀態(tài)。使用保定器械對(duì)動(dòng)物進(jìn)行固定，將三聚氰胺和三聚氰酸與飼料混合后口服。記錄染毒時(shí)間，并觀察、記錄動(dòng)物的狀態(tài)和臨床癥狀。

2.2 臨床指標(biāo)觀察

詳細(xì)觀察和記錄動(dòng)物染毒前、后中毒癥狀出現(xiàn)的時(shí)間及臨床癥狀，包括呼吸狀態(tài)、體溫變化、排尿狀況、排便狀況、精神、行為等。染毒后進(jìn)行臨床觀察至染毒后48 h，每天觀察2次（間隔12 h），包括食欲、精神狀態(tài)、呼吸、鼻腔分泌物、尿液、糞便等。

2.3 樣本采集

攻毒前2 h試驗(yàn)動(dòng)物靜脈采集抗凝血3 mL，收集尿液3 mL，糞便100 g。

染毒后 0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h 靜脈采血 3 mL，抗凝處理，分離血漿，冷藏待檢。染毒后1h、4h、12h、24 h收集尿液。

染毒后48 h，安樂死處理試驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行病理解剖。取腎臟和肝臟，冷凍后待檢。

2.4 三聚氰胺和三聚氰酸檢測(cè)

對(duì)收集的血樣、尿樣、糞樣和組織器官樣本，使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）方法進(jìn)行三聚氰胺和三聚氰酸檢測(cè)[3-5]。

3 結(jié)果

3.1 狐貍?cè)径厩啊⒑笈R床癥狀

對(duì)12只狐貍體重、體溫、精神狀態(tài)及糞便進(jìn)行了染毒前、后檢查。染毒前，各組動(dòng)物的體溫正常，平均體溫為（39.0±0.2）℃；體重基本一致（10±0.5）Kg；精神狀態(tài)良好；呼吸、排尿和排糞正常，符合試驗(yàn)要求。

染毒后，Ⅰ組陰性對(duì)照動(dòng)物未見明顯異常臨床癥狀；Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組染毒后6h動(dòng)物相繼出現(xiàn)食欲降低、呼吸急促、不安定的臨床癥狀。

3.2 狐貍?cè)径竞蟛±兓?/h3>

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行解剖檢查，Ⅰ組陰性對(duì)照動(dòng)物剖檢和病理切片檢查肝臟、腎臟未見明顯異常。Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組試驗(yàn)組肝臟、腎臟均有不同程度腫脹，顏色變淡，同時(shí)，將腎臟和肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋后制作病理切片，觀察腎小球、腎小管、肝細(xì)胞、肝竇和肝血管病理變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染毒動(dòng)物的肝臟細(xì)胞有輕度腫脹，細(xì)胞索有異常變化，肝血管內(nèi)有異物（圖1）；腎臟中腎小球、腎小管病變明顯，腎小球壞死，腎小管壁損傷，管腔內(nèi)有異物（圖2）。

圖1 肝臟組織病理學(xué)變化Fig.1 Histopathological changes in the liver Green arrows.

圖2 腎臟組織病理學(xué)變化Fig.2 Histopathological changes in the kidney

3.3 三聚氰胺和三聚氰酸殘留檢測(cè)

采集血樣、尿樣、肝臟和腎臟樣品，LC-MS方法檢測(cè)三聚氰胺和三聚氰酸殘留。Ⅰ組陰性對(duì)照動(dòng)物的血漿、尿液、肝臟和腎臟中未檢出三聚氰胺和三聚氰酸殘留；Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組動(dòng)物中的血漿、尿液、肝臟和腎臟中有不同程度的三聚氰胺和三聚氰酸殘留。血漿中的三聚氰胺和三聚氰酸殘留在染毒后0.5 h可以檢測(cè)出，在染毒后2h達(dá)到了殘留最高值，然后隨著代謝過程，殘留在逐漸減少，至染毒后24h殘留值已降低至較低水平（圖3、圖4）。尿液中的三聚氰胺和三聚氰酸殘留代謝變化趨勢(shì)與血漿中的殘留變化趨勢(shì)相近，在染毒后2 h達(dá)到了殘留最高值，且染毒后各時(shí)間點(diǎn)的殘留值均比血漿中的高（圖5、圖6）。試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行解剖，采集肝臟和腎臟，并對(duì)肝臟和腎臟中三聚氰胺和三聚氰酸殘留進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著染毒劑量的增加，肝臟和腎臟中的殘留值越高，且各組中三聚氰酸的殘留值大于三聚氰胺（圖7）。

圖3 三聚氰胺在血漿中的殘留Fig.3 MA residues in plasma

圖4 三聚氰酸在血漿中的殘留Fig.4 CYA residues in plasma

圖5 三聚氰胺在尿中的殘留Fig.5 MA residues in urine

圖6 三聚氰酸在尿中的殘留Fig.6 CYA residuesin urine

4 討論

三聚氰胺在動(dòng)物體內(nèi)屬于惰性代謝。Mast等[6]給予Fischer 344大鼠口服單劑量14C標(biāo)記的三聚氰胺0.38 mg，進(jìn)入體內(nèi)后很快由尿排出；被攝入的三聚氰胺90%在第1個(gè)24h內(nèi)被排出，有極少部分由呼吸和糞便排出；三聚氰胺在血中、肝臟內(nèi)和血漿中的濃度基本相同，表明其是在體液中分布的。在腎臟和膀胱處用14C測(cè)得的放射性水平較血漿中高，膀胱內(nèi)最高，這可能是由于尿液的反向彌散作用，也可能是由于尿液對(duì)膀胱組織的污染所致。24 h及24 h之后未再觀察到各種組織內(nèi)有殘余的放射性。

目前認(rèn)為，三聚氰胺誘發(fā)的結(jié)晶形成可能與三聚氰胺和三聚氰酸在尿液中形成的不溶性三嗪復(fù)合物有關(guān)，在酸性環(huán)境中，三聚氰胺和三聚氰酸容易生成不溶性鹽而引發(fā)結(jié)晶形成，而在堿性環(huán)境下，不溶性結(jié)晶易于溶解排出[7，8]。因攝食習(xí)性不同，肉食性動(dòng)物貓、狗和狐貍尿液呈酸性，雜食性動(dòng)物大鼠和豬尿液呈中性，而食草性動(dòng)物牛和羊尿液呈堿性，這種不同動(dòng)物種屬尿液pH值的差異可能是三聚氰胺毒性的物種感受性差異原因之一。

本研究通過口服三聚氰胺和三聚氰酸混合物對(duì)狐貍大劑量暴露的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，對(duì)三聚氰胺和三聚氰酸混合物在雄性狐貍血液、尿液、肝臟和腎臟組織內(nèi)的代謝規(guī)律及對(duì)肝臟、腎臟的病理?yè)p傷程度進(jìn)行了分析和評(píng)估。研究表明，三聚氰胺和三聚氰酸混合物在體液中的代謝變化趨勢(shì)較為一致，說明三聚氰胺和三聚氰酸主要代謝途徑為體液，然后到達(dá)肝臟和腎臟沉積，造成肝臟和腎臟的病理學(xué)損傷。本試驗(yàn)為評(píng)估狐貍?cè)矍璋泛腿矍杷峄旌衔镏卸咎峁┛茖W(xué)依據(jù)。