趙麟萱，高卓林，王瑩，白麗婷，趙倩倩，禹珊珊，汪平，董藝霖，金向群

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130021）

肝臟是人體內(nèi)重要的代謝解毒器官[1-2]，可通過(guò)代謝清除包括酒精在內(nèi)的某些化學(xué)物質(zhì)、毒性物質(zhì)及藥物等，但肝臟也因此較易受到毒性物質(zhì)的損害，造成肝損傷[3-5]。若化學(xué)性肝損傷進(jìn)一步發(fā)展，則會(huì)導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化，直至肝癌，嚴(yán)重危害人類的健康，因此由化學(xué)物質(zhì)引起的肝損傷應(yīng)引起足夠的重視[6]。

保肝軟膠囊是以葛根、肉豆蔻、梔子、沙棘4味藥材為主要原料制成的保健食品。這4種均為藥、食同源類藥材，毒副作用小，具有顯著的保肝作用[7]。葛根是中醫(yī)學(xué)中經(jīng)典的解酒護(hù)肝藥物，含有葛根素、大豆苷、大豆苷元等功效成分，對(duì)肝臟具有明顯的保護(hù)作用[8]；肉豆蔻具有消炎抗氧化的功效，可對(duì)GaIN引起的肝損傷起到預(yù)防作用[9]；梔子具有清熱涼血、解酒毒的功效[10]；沙棘富含多種有機(jī)酸和黃酮類化合物等保肝活性物質(zhì)[11]。4藥合用可顯著增強(qiáng)養(yǎng)肝、護(hù)肝的作用。

本試驗(yàn)采用酒精肝損傷模型，選取SPFICR級(jí)雄性小鼠（體重18～22g），分別經(jīng)口給予相當(dāng)于成人攝入量5、10、30倍的保肝軟膠囊即0.25、0.50、1.50mg/（kg d），連續(xù)灌胃30 d，進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)及組織病理學(xué)檢查，研究保肝軟膠囊對(duì)其化學(xué)性肝損傷小鼠體重變化以及相關(guān)生化指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 受試物保肝軟膠囊，鋁塑板裝，外包裝為紙盒，0.5 g/粒，由吉林大學(xué)提供。

雄性小鼠（50只，體重18～22 g，SPF ICR 級(jí)別）、小鼠基礎(chǔ)飼料，長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，小鼠生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（吉）2011-0004，飼料生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（吉）2010-0001。

清潔級(jí)動(dòng)物室環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：吉?jiǎng)釉O(shè)字10-1005號(hào)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2015-0020，動(dòng)物室溫度20～22℃，濕度55%～65%。

1.1.2 儀器和試劑 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（XTL-2400，上海元析儀器有限公司）；冰凍切片機(jī)（LEICA CM510）、病理顯微鏡（DM4000B）（德國(guó)徠卡儀器有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀（TBA-120FR，日本東芝株式會(huì)社）。

還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成科技有限公司）；甘油三酯（TG）試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、空白對(duì)照組及保肝軟膠囊低、中、高劑量組，每組10只。3個(gè)劑量組的灌胃劑量分別按照成人攝入量的5、10、30倍設(shè)置，即分別為0.25、0.50、1.50g/（kg d）。模型和空白對(duì)照組均灌胃等體積的溶媒橄欖油，0.1mL/（10g d），連續(xù)灌胃30 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，將模型對(duì)照組和3個(gè)劑量組1次灌胃50%乙醇（以蒸餾水稀釋）0.12mL/（10g d），空白對(duì)照組給予同體積蒸餾水。禁食16h后，全部處死，取肝臟，進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)及組織病理學(xué)檢查。

1.2.2 肝臟組織生化指標(biāo)檢測(cè) 取肝臟1.0g，加生理鹽水9mL，充分研磨制成10%肝勻漿。按照試劑盒提取方法對(duì)肝勻漿中丙二醛、還原型谷胱甘肽、甘油三酯及組織蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 肝臟組織病理學(xué)檢查 從動(dòng)物肝左葉中部做橫切面取材，冰凍切片，蘇丹Ⅲ染色，鏡下觀察脂滴在肝臟中的分布、范圍和面積。每例動(dòng)物肝組織用40倍物鏡連續(xù)記錄70個(gè)視野，每個(gè)視野根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞（含脂滴的肝細(xì)胞）多少和分布的范圍，按0、1、2、3、4分進(jìn)行評(píng)分，將70個(gè)視野所得分?jǐn)?shù)的平均值作為該例肝組織的脂肪染色評(píng)分。病理組織學(xué)觀察以肝細(xì)胞脂肪染色作為觀察指標(biāo)，并根據(jù)病理改變程度“0”、“1”、“2”、“3”、“4”量化，進(jìn)行肝損傷程度的評(píng)價(jià)。肝細(xì)胞脂肪染色共分為5級(jí)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 用SPSS11.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行均值比較，方差齊時(shí)，各組間兩兩比較用LSD法；方差不齊時(shí)，各組間兩兩比較采用Tamhane's法。P＜0.05，表示差異顯著，證明該數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 結(jié)果判定 肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的結(jié)果為陽(yáng)性；肝臟MDA、還原性GSH和TG 3項(xiàng)指標(biāo)中任2項(xiàng)指標(biāo)為陽(yáng)性和病理組織學(xué)檢查結(jié)果為陽(yáng)性，2種條件滿足1種，即可判定受試樣品對(duì)酒精性肝損傷具有輔助保護(hù)作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重的影響

各試驗(yàn)組及空白對(duì)照組始重、終重、增重與模型對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果顯示，該樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重并未見(jiàn)明顯影響。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織中MDA、GSH、TG含量的影響

連續(xù)給予受試物30d，取肝組織，測(cè)定10%肝勻漿中MDA、GSH、TG的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，模型對(duì)照組脂肪變性評(píng)分與空白對(duì)照組比較有極顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明模型成立；與高劑量組比較有顯著性差異（P＜0.05）；與中、低劑量組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。說(shuō)明高劑量組脂肪變性評(píng)分低于模型對(duì)照組。

表3 保肝軟膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織中MDA含量的影響Table 3 Effect of hepatoprotective soft capsule on MDA content in liver tissue of experimental animals

由表3可見(jiàn)，模型對(duì)照組MDA、GSH、TG的含量 與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明模型成立；其中，MDA、GSH和TG含量與高劑量組比較有顯著性差異（P＜0.05），與中、低劑量組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明高劑量組有降低肝組織中MDA、TG，升高GSH含量的作用。

2.3 肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果

連續(xù)給予受試物30 d，取肝組織，冰凍切片，蘇丹III染色，鏡下觀察脂滴在肝臟中的分布、范圍和面積，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 保肝軟膠囊肝臟脂肪變性評(píng)分結(jié)果Table4 Liver steatosis scoreof hepatoprotective soft capsule

3 結(jié)論與討論

保肝軟膠囊按低、中、高3種劑量連續(xù)灌胃小鼠30d，結(jié)果顯示，高劑量組肝勻漿中MDA和TG含量均低于模型對(duì)照組，GSH含量高于模型對(duì)照組（P＜0.05）；高劑量組的脂肪變性評(píng)分低于模型對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠體重均未出現(xiàn)明顯影響。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能檢驗(yàn)方法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)可知，保肝軟膠囊對(duì)化學(xué)性肝損傷具有輔助保護(hù)功能。

肝臟在人體中發(fā)揮著重要的代謝、解毒功能。由于自然環(huán)境狀況日益惡劣以及人們?nèi)粘＝浑H活動(dòng)的大幅增加，我國(guó)已逐漸成為一個(gè)肝臟疾病高發(fā)的國(guó)家，對(duì)我國(guó)國(guó)民健康造成了巨大的威脅。隨著人們對(duì)醫(yī)療知識(shí)的了解與保健意識(shí)的加強(qiáng)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到治病不如防病，人們從注重治療轉(zhuǎn)向注重預(yù)防。尋找一個(gè)療效確切、副作用較小、易被人們接受的中藥保健藥物顯得尤為重要。本試驗(yàn)所用的保肝軟膠囊是一種純中藥制劑，主要用于預(yù)防與緩解化學(xué)性肝損傷，該制劑的處方是根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)并經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期觀察不斷改進(jìn)最終確定，由葛根、肉豆蔻、沙棘與梔子這4味藥、食同源的中藥材組成。該軟膠囊功效顯著、成本低廉，能夠減少藥物依賴性的產(chǎn)生，有效輔助化學(xué)性肝損傷的治療。因此，保肝軟膠囊若能夠得到充分的開(kāi)發(fā)利用，將使化學(xué)性肝損傷患者的生活質(zhì)量得到大幅提升。