劉艷環(huán)，朱言柱，王玉方，王長(zhǎng)鳳，苗利光，李海濤

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112）

沙門(mén)氏菌是一種常見(jiàn)的食物傳播性人、畜共患病病原菌，可通過(guò)被污染的食品、飼料感染人和動(dòng)物，臨床表現(xiàn)為敗血癥、胃腸炎、妊娠中斷及其他組織的局部炎癥和食物中毒。不同動(dòng)物的沙門(mén)氏菌病在世界各地廣泛分布，對(duì)人和動(dòng)物的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[1]。控制食品及飼料污染是預(yù)防和控制沙門(mén)氏菌病的重要環(huán)節(jié)。因此，快速、準(zhǔn)確地檢驗(yàn)食品、飼料中的沙門(mén)氏菌對(duì)防止人和動(dòng)物沙門(mén)氏菌感染具有重要意義。

目前，對(duì)沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)主要采用傳統(tǒng)的病原分離鑒定方法[2-3]，此種方法比較煩瑣且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，假陰性率較高，已不能滿足疫病控制和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，一些新的細(xì)菌檢測(cè)方法在沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)中得到嘗試和運(yùn)用，這些方法不僅彌補(bǔ)了病原分離鑒定方法的不足，同時(shí)加快了檢驗(yàn)速度，得到人們的廣泛關(guān)注[4-6]。分子生物技術(shù)，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的迅猛發(fā)展為建立快速、準(zhǔn)確的沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)方法提供了技術(shù)支持[7]。但運(yùn)用PCR技術(shù)快速檢驗(yàn)食品及動(dòng)物飼料中的沙門(mén)氏菌，國(guó)內(nèi)至今沒(méi)有一種有效的方法問(wèn)世。PCR技術(shù)的關(guān)鍵是引物的篩選及樣品的處理。沙門(mén)氏菌是由一大群血清型（2 000多種）相關(guān)的革蘭氏陰性、蒹性厭氧桿菌組成，為引物的篩選帶來(lái)了一定的困難[8]，另外，食品及動(dòng)物性飼料成份比較復(fù)雜，尋找一種即不影響正常PCR反應(yīng)又簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速的樣品處理方法有一定的難度。本項(xiàng)研究建立了一種適合于食品和動(dòng)物性飼料沙門(mén)氏菌污染檢測(cè)的PCR方法。

1 材料

1.1 供試菌種

雞白痢沙門(mén)氏菌（Salmonella pullorum）C79-13、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（S.typhi）C77-32、豬霍亂沙門(mén)氏菌（S.cholerasuis）A72-32（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；壞死桿菌（Fusobacterium necrophorum）、綠膿桿菌（Pseudomonas acruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）C600（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所疫病室分離或保存）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

PCR儀（MJResearch公司）；離心機(jī)（Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 沙門(mén)氏菌的培養(yǎng)、分離與鑒定

按沙門(mén)氏菌傳統(tǒng)方法進(jìn)行培養(yǎng)、分離與鑒定。

2.2 菌株DNA的提取

參照革蘭氏陰性桿菌 DNA快速提取法提取DNA。

2.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)沙門(mén)氏菌毒力因子基因（AE008832.1）保守序列設(shè)計(jì)特異引物，由北京賽百盛公司合成。

2.4 樣品處理

2.4.1 魚(yú)粉 無(wú)菌取0.1～0.3g樣品于1.5mLEppendorf管中，加TE至0.5 mL混勻，靜置20 min。取全部上清，12000r/min離心5min，留沉淀，用50LTE懸浮。加1mol/L的Tris堿2L。100℃加熱9min后冰浴1min。12000r/min離心5min。取5L上清于50LPCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2.4.2 肉骨粉和蛋制品 無(wú)菌取0.1～0.3g樣品于1.5mL Eppendorf管中，加TE至0.5 mL混勻，靜置20 min。取全部上清，12 000 r/min離心5 min，留沉淀，用50L TE懸浮。100℃加熱9min后冰浴1min。12000r/min離心5 min。取5L上清于50LPCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2.4.3 魚(yú)罐頭 無(wú)菌取0.1～0.3g樣品于1.5mLEppendorf管中，加TE至0.5mL混勻，靜置20min。12000r/min離心5min，去上清。用STE混勻，吸出液體部分于另一Eppendorf管中。12000r/min離心5min，去上清。取20L滅菌水懸浮沉淀，100℃加熱9 min后冰浴1 min。

2.4.4 殘留 DNA的樣品處理 一般樣品：無(wú)菌取0.1～0.3g樣品于1.5mLEppendorf管中，加TE至0.5mL混勻，靜置20 min，12 000 r/min離心10 min。取全部上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇靜置10 min。12 000 r/min離心5 min。沉淀干燥后加30L滅菌水溶解。

油脂含量高的樣品：無(wú)菌取0.1～0.3g樣品于1.5mL Eppendorf管中，加TE至0.5mL混勻，靜置20min。取上清，加10L 1 mol/L 的 Tris堿，50℃2～3 min，仔細(xì)去油層。100℃加熱10 min后冰浴1 min。加入等體積的酚搖勻，12000r/min離心5min。取上清，加入等體積的酚/氯，12 000 r/min離心5 min。取上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，靜置10 min，12 000 r/min離心10 min。沉淀干燥后加30L滅菌水溶解。

2.4.6 特異性試驗(yàn) 擴(kuò)增由各種菌株提取的DNA，擴(kuò)增人為污染樣品，同時(shí)以非污染樣品作對(duì)照。

2.4.7 PCR敏感性試驗(yàn) 用TE將沙門(mén)氏菌分別稀釋成 5 10 cfu/mL、1 102cfu/mL、2 102cfu/mL、2 103cfu/mL、2 104cfu/mL、2 105cfu/mL與 0.1～0.3 g樣品混合，經(jīng)處理后取5L進(jìn)行PCR，同時(shí)以非沙門(mén)氏菌與樣品混合物作對(duì)照。

2.4.8 復(fù)合性試驗(yàn) 隨機(jī)抽取魚(yú)罐頭、蛋制品、魚(yú)粉、肉骨粉樣品各10份，用該P(yáng)CR方法檢測(cè)，同時(shí)用傳統(tǒng)的病原分離鑒定方法對(duì)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，驗(yàn)證該P(yáng)CR方法的應(yīng)用效果。

3 結(jié)果與分析

3.1 特異性試驗(yàn)

圖1 細(xì)菌DNA PCR特異性Fig.1 Bacterial DNA PCRspecificity

圖2 樣品PCR特異性Fig.2 Sample PCRspecificity

3.2 敏感性試驗(yàn)

圖3 魚(yú)粉PCR敏感性試驗(yàn)Fig.3 PCRsensitivity of fish meal

圖4 皮蛋、肉骨粉PCR敏感性Fig.4 PCRsensitivity of preserved egg,meat and bone meal

圖5 魚(yú)罐頭PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 PCRSensitivity of preserved canned fish

3.3 復(fù)合性試驗(yàn)

用PCR方法在抽取的魚(yú)粉中未檢出陽(yáng)性結(jié)果，而肉骨粉有3個(gè)為陽(yáng)性；用傳統(tǒng)的病原分離鑒定方法在魚(yú)粉中未檢出陽(yáng)性結(jié)果，在肉骨粉中檢出1份為陽(yáng)性，該份樣品是PCR檢驗(yàn)3個(gè)陽(yáng)性樣品中的一份。實(shí)驗(yàn)證明，該P(yáng)CR方法可以檢出樣品中已死亡的沙門(mén)氏菌，而病原分離鑒定法無(wú)法檢出，說(shuō)明PCR方法有更高的檢出率。

4 討論

沙門(mén)氏菌是食物中毒中最常見(jiàn)的致病菌，在我國(guó)占食物中毒的第一位。在被沙門(mén)氏菌污染的食品和飼料中，常有一些存活不能培養(yǎng)或死亡的沙門(mén)氏菌存在，這些沙門(mén)氏菌及其殘留物用常規(guī)檢測(cè)方法難以檢出。而采用PCR方法，設(shè)計(jì)合適的引物，能夠有效地檢出沙門(mén)氏菌及其殘留物。

本實(shí)驗(yàn)選取沙門(mén)氏菌污染較為嚴(yán)重的肉類和蛋類進(jìn)行試驗(yàn)。為排除樣品中蛋白質(zhì)對(duì)提取模板DNA的影響，先用酚－氯仿進(jìn)行粗提，之后用試劑盒純化回收，取得較好效果。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，121℃15min處理的樣品的PCR檢測(cè)靈敏度要比100℃10 min處理樣品低10～100倍，說(shuō)明高溫處理導(dǎo)致一些模板DNA序列的裂解，從而降低了檢測(cè)靈敏度，另外，在相同處理?xiàng)l件下，不同樣品PCR檢測(cè)靈敏度有很大差異，造成這種差異的原因還需進(jìn)一步研究。