劉曉穎，王卓，劉晗璐，鮑坤，李光玉※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

梅花鹿是具有經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值的動(dòng)物之一，食性廣，耐粗飼。梅花鹿瘤胃內(nèi)寄居著大量的細(xì)菌、真菌、原蟲、噬菌體和產(chǎn)甲烷菌等微生物，采食的精、粗飼料等物質(zhì)在這些微生物的作用下，轉(zhuǎn)化為梅花鹿生長(zhǎng)所需的脂肪酸、氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。目前，隨著我國(guó)藥物飼料添加劑將在2020年全部退出，益生菌制劑作為抗生素的替代品，可減少疾病的發(fā)生，且具有促生長(zhǎng)、無(wú)公害、無(wú)殘留、無(wú)污染等特點(diǎn)。然而，細(xì)菌具有宿主特異性，因此，用于益生菌的菌株以本動(dòng)物源的菌株最佳。

由于芽孢桿菌在一定條件下生成芽孢，因此，具有耐受高溫、耐酸堿、易于保存等特點(diǎn)，且在消化道中可以利用氧氣，從而抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此，經(jīng)常被用做益生菌的候選菌株。本試驗(yàn)利用芽孢桿菌的耐高溫特性，從梅花鹿瘤胃液中分離出7株芽孢桿菌，并通過(guò)細(xì)菌的生物學(xué)特征、16SrRNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建相結(jié)合的方法，對(duì)這7株芽孢桿菌進(jìn)行鑒定和分類，以豐富梅花鹿瘤胃微生物資源數(shù)據(jù)庫(kù)，并為梅花鹿益生芽孢桿菌的研究開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 瘤胃液采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所鹿場(chǎng)裝有永久瘤胃瘺管的梅花鹿[2]。

1.1.2 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基等均按有關(guān)文獻(xiàn)[3]配制；細(xì)菌微量生化鑒定管（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；革蘭氏快速染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；厭氧袋和厭氧產(chǎn)氣袋（日本3M公司）。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離 將采集的梅花鹿瘤胃液用保溫盒保存快速帶回實(shí)驗(yàn)室，用無(wú)菌2層紗布過(guò)濾去掉殘?jiān)?，?mL加入到9mL無(wú)菌生理鹽水中混勻，85℃水浴20 min；取0.5mL水浴后的瘤胃液，涂布于2個(gè)LB固體平板上，其中1個(gè)平板置于厭氧袋中，于37℃溫箱中，待長(zhǎng)出菌落后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行涂片鏡檢。將G+桿菌菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行第2次劃線分離。最后，將所得菌種進(jìn)行第3次純化并保存。

1.2.2 菌株生理生化鑒定 將上述分離的疑似芽孢桿菌接種到生理生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，進(jìn)行糖類發(fā)酵等生理生化指標(biāo)的測(cè)定，同時(shí)，對(duì)單菌落進(jìn)行觸酶測(cè)定。

1.2.3 菌株16SrRNA序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 分離純化的細(xì)菌進(jìn)行總DNA提取（操作按說(shuō)明書進(jìn)行），凝膠電泳顯示有DNA，提取細(xì)菌總DNA送至長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司進(jìn)行16SrRNA序列測(cè)定。所得序列利用EZTAXON軟件在EzBio Cloud上進(jìn)行同源性比較。選取同源性較高的典型菌株，將7株菌株與典型菌株序列利用MeGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離細(xì)菌的特點(diǎn)

根據(jù)分離出的細(xì)菌菌落特征、菌體形態(tài)，分離出7株芽孢菌，DYJ-7呈菜花樣菌落，DY-12和DYX-7呈灰白色干酪樣菌落，而 DY-1、DY-10、DY-4、DY-14呈薄層白色菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察，菌體均為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，長(zhǎng)短不一，兩端呈圓形，單個(gè)或成對(duì)存在，有的菌體有芽孢。

2.2 分離菌株的生理生化鑒定

觸酶試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的7株細(xì)菌觸酶試驗(yàn)結(jié)果均呈陽(yáng)性；7株菌糖發(fā)酵試驗(yàn)中木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、棉子糖均呈陰性；7株分離菌的靛基質(zhì)反應(yīng)、苯丙氨酸、MR試驗(yàn)結(jié)果也均呈陰性；DY-10在所有的糖發(fā)酵管中都不反應(yīng)，其余6株均能利用葡萄糖；DY-12、DYJ-7硝酸鹽還原試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，其余5株分離菌呈陽(yáng)性。分離菌株的具體生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 菌株特異性16SrRNA的序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建[5-6]

對(duì)7株分離的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)，7株菌16SrRNA序列長(zhǎng)度為1 400 bp左右，與EzBioCloud上EZTAXON序列進(jìn)行比對(duì)，DYJ-7與地衣芽孢桿菌的序列相似性達(dá)99.76%；DY-12、DYX-7與枯草芽孢桿菌的序列相似性達(dá)100%；DY-4與木聚賴氨酸桿菌的序列相似性達(dá)99.37%；DY-10與大型賴氨酸桿菌的序列相似性達(dá)99.58%；DY-1、DY-14與紡綞形賴氨酸芽孢桿菌的序列同源性達(dá)99.58%。結(jié)合分離菌株革蘭氏染色陽(yáng)性、菌落形態(tài)特征、生理生化特征，最后確定分離的7株細(xì)菌中3株隸屬芽孢桿菌科芽孢桿菌屬，4株隸屬芽孢桿菌科賴氨酸芽孢桿菌屬。將7株菌株的16SrRNA序列與GenBank上3株同源性較高的菌株序列Bacillussubtilisstrain DOSSTR-3 (MF076235.1)、B.licheniformis strain P15（MG753545.1）、Lysinibacillusfusiformisstrain BCH540（KM983010.1），利用MeGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖1所示。從圖1可以看出，菌株DY-12、DYX-7與DYJ-7 親緣關(guān)系較近，而DY-4、DY-14 與DY-1、DY-10親緣關(guān)系較近。

表1 7株梅花鹿瘤胃分離細(xì)菌的生理生化鑒定結(jié)果Table 1 The physiological and biochemical identification results of 7 strains of isolated bacteria from the rumen of sika deer

圖1 7株分離菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of 7 isolates of bacteria

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用85℃水浴20 min LB平板培養(yǎng)基，根據(jù)分離菌株的菌落特征、具體形態(tài)，從梅花鹿瘤胃液中分離出7株芽孢菌，DYJ-7呈菜花樣菌落，DY-12、DYX-7呈灰白色干酪樣菌落，DY-1、DY-10、DY-4、DY-14呈黃色、半透明、濕潤(rùn)菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察，菌體均為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，長(zhǎng)短不一，兩端呈圓形，單個(gè)或成對(duì)存在，有的菌體有芽孢，隨著培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基酸堿度的改變，菌體大小也有差異。

對(duì)分離的7株細(xì)菌進(jìn)行部分生理生化鑒定，觸酶試驗(yàn)結(jié)果均呈陽(yáng)性，不能利用木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、棉子糖，靛基質(zhì)反應(yīng)、苯丙氨酸、MR試驗(yàn)結(jié)果呈陰性；DY-10在所有的糖發(fā)酵試驗(yàn)均都不反應(yīng)，其余6株均能利用葡萄糖；DY-12、DY-7硝酸鹽還原試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，其余5株呈陽(yáng)性。

雖然7株分離菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)、顏色、革蘭氏染色鏡下形狀不同，但由于細(xì)菌的多樣性，只是通過(guò)菌落形態(tài)、染色特性和生理生化鑒定并不能確定，為此本試驗(yàn)提取了7株純化細(xì)菌的基因組DNA，進(jìn)行了16S rRNA的測(cè)序，并進(jìn)行了同源性分析。將7株菌株的16SrRNA序列與3株同源性較高的菌株GenBank上的序列，利用MeGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化指標(biāo)，確定分離的7株細(xì)菌中3株菌為芽孢桿菌科芽孢桿菌屬，4株菌為芽孢桿菌科賴氨酸芽孢桿菌屬。